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Apoptosis (Muerte celular programada)

Resumen: Nuestras células desde los glóbulos rojos hasta las neuronas viven días o años ejecutando sus funciones específicas sin descanso. En cualquier momento un accidente bioquímico disparado por el humo de un cigarrillo, la luz solar o un resfriado les daña su ADN de forma irreparable. Acto seguido la célula, de forma altruista, ejecuta su autodestrucción haciendo uso de un programa establecido genéticamente durante millones de años de evolución. Este complejo proceso se llama: apoptosis y ocurre 100 000 veces cada segundo de una vida humana.

Publicación enviada por Lic. Mailin Borroto Castellano y Dr. Esmir Camps Calzadilla




 


RESUMEN
Nuestras 1014 células desde los glóbulos rojos hasta las neuronas viven días o años ejecutando sus funciones específicas sin descanso. En cualquier momento un accidente bioquímico disparado por el humo de un cigarrillo, la luz solar o un resfriado les daña su ADN de forma irreparable. Acto seguido la célula, de forma altruista, ejecuta su autodestrucción haciendo uso de un programa establecido genéticamente durante millones de años de evolución. Este complejo proceso se llama: apoptosis y ocurre 100 000 veces cada segundo de una vida humana.

La muerte celular comenzó a considerar como un fenómeno fisiológico e importante dentro del proceso de desarrollo de los organismos poco después del descubrimiento realizado sobre la mitad del siglo XIX de que los organismos estaban compuestos por células. Las primeras observaciones que se conocen en relación con la muerte celular fisiológica fueron realizadas en la metamorfosis de anfibios por Vogt en 1842 y posteriormente se realizaron estas mismas descripciones en otros tejidos en desarrollo., tanto de invertebrados como de vertebrados. desde la fecha hasta la actualidad se ha acumulado un enorme volumen de información acerca del tema por lo cual nos proponemos brindar una actualización acerca de las principales teorías mas aceptadas actualmente relacionada a la muerte celular programada.

Palabras claves: apoptosis, muerte celular programada, daño al ADN.

ÍNDICE
Introducción
Objetivos
Desarrollo
Conclusiones
Bibliografía
Anexos

INTRODUCCIÓN
Antecedentes históricos
El concepto de muerte celular programada fue acuñado por Lockshin y Williams en 1964 y describía la muerte de las células que ocurría en lugares y momentos determinados como eventos programados dentro del plan de desarrollo del organismo. Años después, en 1972, los científicos escoceses Kerr, Wyllie y Currie a partir de una recopilación de evidencias morfológicas, establecieron las diferencias entre dos tipos de muerte celular. La patológica que ocurre, por ejemplo, en el centro de una lesión aguda como trauma o isquemia, está caracterizada por la ruptura celular y recibe el nombre de necrosis celular, y la fisiológica, que ocurre durante el desarrollo o la hemostasis del organismo, que mantiene la integridad de la célula y a la que Kerr y sus colaboradores llamaron apoptosis. Según este grupo, la muerte por apoptosis respondía a un programa de muerte intracelular que podía ser activado o inhibido por una variedad de estímulos, tanto fisiológicos como patológicos.

En 1982 tuvo lugar un descubrimiento que abrió las puertas al estudio profundo de las bases moleculares y genéticas del proceso de apoptosis. Robert Horvitz, del Instituto de Massachussets en Cambridge, publicó los estudios genéticos realizados sobre el nematodo caenorhabditis elegans en los que se describieron los genes encargados del control y la ejecución de la apoptosis en este organismo. Gracias a la homología existente entre estos genes en c. elegans y organismos superiores, la apoptosis en este nematodo ha sido tomada como referente del proceso en todos los sistemas y esto ha podido identificar una parte importante de la red de mecanismos que lo controlan.

Horvitz y sus colaboradores después de una paciente observación de las células del gusano bajo un microscopio (desde la etapa de embrión hasta el animal adulto) revelaron que, aunque cada gusano generaba 1 090 células, el animal adulto consistía de sólo 959 células. Exactamente 131 células del embrión del gusano estaban programadas para morir, a menudo a los pocos minutos de su nacimiento.

Centrándose en este programa de suicidio, Horvitz identificó una “vía de la muerte”, tres pasos que siguen las células condenadas: “Primero se mata a la célula”, dice Horvitz en tono dramático. “Después”, y su voz se profundiza, “se deshace del cuerpo. Y en tercer lugar, se destruye la evidencia”; describiendo el investigador que distintos genes controlan cada uno de estos pasos; alrededor de 15 genes del gusano desempeñan una cierta función en la apoptosis. Tal descubrimiento lo hizo merecedor en el año 2002 del Premio Nobel de Fisiología y Medicina junto a los científicos Sydney Brenner y John Sulston.

OBJETIVO
- Revisar fuentes bibliográficas actualizadas sobre los mecanismos implicados en la muerte celular programada (apoptosis) y sus ventajas para el mantenimiento de la vida.

DESARROLLO
El término apoptosis (del griego ptosis: caída) fue originalmente usado por los botánicos. A principios de la década de 1970 Kerr, Wyllie y Currie lo reacuñaron para describir la muerte de las células del hígado que, después de encogerse y marchitarse, se desprendían de este órgano como hojas en otoño.

La apoptosis es un fenómeno biológico fundamental, permanente, dinámico e interactivo. Existen mecanismos pro o anti apoptósicos, regulados genéticamente, que actúan en forma activa (pues consumen energía) y equilibrada. Como función necesaria para evitar la sobreproducción celular era sospechada por los biólogos; pero es un proceso ordenado y "silencioso" que no produce reacción tisular y por ello difícil de captar.

La apoptosis puede estar frenada, en equilibrio o estimulada. Por ejemplo, está frenada durante el desarrollo de espermatogonias, en las criptas de las glándulas intestinales (que es un epitelio de crecimiento rápido) y durante la lactancia en su período preparatorio, en que el tejido mamario aumenta su masa celular. Está en equilibrio respecto de la mitosis en los tejidos adultos sanos. Se ha observado en epitelios adultos normales del hígado, mama, corteza suprarrenal y tubo digestivo. Es muy significativo su rol homeostático en la médula ósea, donde debe destruir en forma permanente, la mitad de una inmensa cantidad de células que solo en leucocitos significa 5 x 10 elevado a 11, cada 24 Hrs. Está estimulada cuando existen células envejecidas, mutadas neoplásicas o no neoplásicas, alteradas por tóxicos y las que están en proceso de metamorfosis o atresia. Se ha estudiado esta condición en neutrófilos envejecidos, en megacariocitos con citoplasma agotado por producción excesiva de plaquetas, en la atresia folicular del ovario, en folículos pilosos en evolución y en la mama durante la involución post-lactancia.

Dos formas de muerte celular son habituales en el organismo: necrosis y apoptosis. Las características morfológicas de ambas, permiten , en la mayoría de los tejidos establecer claras diferencias.

En la necrosis se observan numerosas células vecinas sometidas a este proceso, cubriendo una extensión variable con desintegración. La destrucción de la membrana celular permite el escape al exterior de elementos tóxicos que provocan un proceso inflamatorio que tendrá efecto nocivo en el organismo, según la extensión del proceso. El material cromatínico sufre una dispersión irregular. Las causas son agentes tóxicos, traumáticos e hipóxicos; siempre patológicos.

En la apoptosis el proceso afecta a determinadas células, no necesariamente contiguas y no a todas en un área tisular. La membrana celular no se destruye, lo que impide el escape al espacio extracelular de su contenido , resultando un proceso "silencioso", sin inflamación. En el citoplasma se produce granulación fina, con conservación de algunos organelos, en especial las mitocondrias que tienen un rol interactivo importante. A nivel nuclear la cromatina se condensa agrupada en varios sectores formando cuerpos apoptósicos. La membrana celular se recoge sobre las eminencias globuliformes que forman los elementos deteriorados del citoplasma y núcleo. Finalmente, fagocitos captan la célula en su totalidad impidiendo en una acción impecable, que se produzca alarma en el resto del tejido.

Se ha demostrado, al menos en tejidos epiteliales, que si algo de material apoptósicos escapa a la acción de los fagocitos, es captado por células vecinas. La participación de células vecinas en este proceso se manifiesta además por la capacidad de éstas de enviar señales moleculares a la célula que debe morir, como mecanismo complementario al que desarrolla la célula misma cuando se determina molecularmente su autodestrucción. El proceso de apoptosis demora entre 30 y 60 minutos en células en cultivo. Uno de los más lentos se produce en células hepáticas empleando como promedio 3 horas.

Sistemas sujetos a apoptosis
La muerte celular programada es un mecanismo básico implicado de forma decisiva en numerosos procesos. Entre ellos podemos destacar:
- DESARROLLO EMBRIONARIO:
- Escultura de numerosas estructuras
- Eliminación de estructuras
- Control de la sobreproducción de células
- Control de células defectuosas
- Formación de células diferenciales especiales
- HOMEOSTASIS
- MECANISMOS SELECTIVOS

Desarrollo embrionario
Las primeras observaciones que se realizaron del fenómeno de la muerte celular programada (MCP) fueron hechas en el contexto del desarrollo. De hecho, como ya se menciona en un apartado anterior, el termino muerte celular programada se comenzó a utilizar para definir la muerte celular ocurrida en determinado momento y en lugar determinado como parte del plan de desarrollo de un organismo. La dificultad que se ha presentado a la hora de estudiar la apoptosis en el desarrollo, es la eficacia en el proceso de aclaramiento de las células apoptóticas.

En algunos sistemas de estudio, las células apoptóticas en gran número de ocasiones eran vistas en el interior de las células vecinas encargadas de fagocitarlas. Esto hace que sea muy difícil calcular hasta donde llega el papel ejercido por la apoptosis en algunos procesos del desarrollo embrionario, ya que el número de células apoptóticas que se pueden identificar en determinado momento en un tejido embrionario es siempre muy bajo, y no se corresponde con la tasa real de apoptosis. Esto hace que en biología del desarrollo, la muerte celular programada esté aún subestimada, aunque se puede suponer la gran importancia que debe tener a partir de los datos de experimentos que muestran, que en organismos complejos, la perdida de funcionalidad del proceso de apoptosis altera el desarrollo de tal forma, que en muchos casos el animal no es viable.

A pesar de las dificultades se han hecho avances a lo largo de los años en el estudio de la apoptosis en este sistema. Se han determinado algunos objetivos que cumple la apoptosis dentro del desarrollo de un organismo, todos encaminados en último lugar, a la eliminación de células sin utilidad en ese momento y lugar. Los objetivos son los siguientes:

Escultura de distintas estructuras
El ejemplo más claro de esto es la eliminación de las membranas interdigitales para la formación de los dedos en vertebrados superiores. Otro proceso de formación de estructuras en que esta involucrada la apoptosis es en el vaciado de cuerpos sólidos para crear una luz. Por ejemplo, la formación de la cavidad preamniotica en el embrión de ratón por la muerte de células ectodermales de su interior.

Eliminación de estructuras
En el proceso de desarrollo a veces se forman estructuras que después es necesario suprimir. La razón es que pueden ser restos vestigiales de alguna estructura necesaria para una especie ancestral pero a la que la evolución ha hecho perder la utilidad. También pueden ser formaciones requeridas para determinados estadios del desarrollo y que después ya no son de utilidad. Por último, también pueden ser estructuras necesarias para un sexo pero no para el otro. Ejemplos de este objetivo de la apoptosis durante el desarrollo son los tubos pronefríticos, necesarios en peces y larvas anfibias pero que han dejado de serlo en mamíferos y por eso son eliminados. También los ductos de Müllerian, que forman el útero y los oviductos en hembras de mamíferos pero que en machos son eliminados por apoptosis.

Control de la sobreproducción de células
En muchos organismos existe, en un principio, una sobreproducción celular y después, el número es ajustado a lo necesario mediante apoptosis. Aunque se había prestado mayor atención al control de proliferación celular como mecanismo de ajuste del número de células en determinado tejido, parece que este mecanismo está controlado principalmente por apoptosis. Un ejemplo es la generación de neuronas y oligodendrocitos que se hace en exceso para después ajustar su número en función del número de células que inervan o de axones que mielinizan respectivamente.

Control de las células defectuosas
Durante el desarrollo, se eliminan por apoptosis células anormales, con localización errónea, no funcionales o potencialmente peligrosas, de forma que solo completen el proceso de desarrollo células no dañadas. Para ilustrar esto existen estudios en los que irradian hembras de ratón durante la gestación. La mayoría de los embriones mueren a consecuencia de esto, pero el incremento de anormalidades en los ratones que nacen es muy baja lo que indica que existe un mecanismo de protección contra el daño celular en el que interviene la apoptosis.

Formación de células diferenciadas especiales
Existen en los organismos ciertos tipos celulares que son especiales ya que han perdido su núcleo y orgánulos en el proceso de diferenciación terminal. Es el caso de los hematíes o los queratinocitos de la piel. Aunque está aún sin determinar, existen indicios de que estos procesos especializados de diferenciación son en realidad formas modificadas de apoptosis.

Existen de todas formas en los organismos en desarrollo mucha más muerte celular de la que se puede explicar, incluso antes de que las células hayan alcanzado el grado de diferenciación que las predisponga hacia determinada función. Se especula que la respuesta a esta muerte celular sin justificación sea un fenómeno de selección continua dentro del proceso del desarrollo.

La muerte de las células durante el desarrollo obedece a una serie de señales. Estas señales pueden proceder de las propias células que van a hacer apoptosis en un proceso de autorregulación, o del exterior. El último parece ser el mecanismo se señalización utilizado en los sistemas estudiados. La señal externa, que puede ser un factor soluble asociado a la membrana de otras células o a la matriz extracelular, puede inducir la supervivencia de la célula o bien inducir su apoptosis. Un ejemplo clásico de inducción de apoptosis mediante una señal de forma sistémica, es la perdida de la cola durante la metamorfosis de los renacuajos en respuesta al incremento en sangre de una hormona tiroidea.

En el proceso global de desarrollo es posible que ocurra una combinación de señales positivas y negativas para dar lugar a que esta se desarrolle de forma favorable.

Homeostasis
Este es un término general que se emplea para designar los mecanismos encargados de la regulación de distintos procesos dentro del organismo. Uno de estos mecanismos de homeostasis, en que la apoptosis juega un papel muy importante, es el de la regulación del recambio de células en los tejidos. La mayoría de los tejidos del organismo experimentan, en mayor o menor medida, un recambio celular sostenido por cierto grado de proliferación de las células que lo componen u originan, acompañado de muerte y posterior eliminación de células "viejas". Esta muerte tiene lugar por apoptosis.

El concepto de senectud de las células está en parte asociado a la acumulación de daños en su material genético, que las convierte en potencialmente peligrosas. Como se podrá ver a continuación, estos daños en el ADN desencadenan respuestas mediadas por quinasas y en último lugar por el factor de transcripción p53, que pueden culminar con la apoptosis de la célula si los daños son suficientemente graves. Otra señal que puede desencadenar la eliminación por apoptosis de una célula dentro de determinado tejido, es la pérdida de adhesiones con la matriz que lo rodea. Este tipo de apoptosis por desarraigo se denomina "anoikis" y, además de eliminar las células que ya han dejado de formar parte del tejido al perder sus conexiones a él, evita que se puedan unir a matrices en otras localizaciones originando una displasia.

La anoikis se descubrió en células epiteliales y endoteliales, y se ha documentado in vivo en un tejido sujeto a un recambio constante como es la piel. En la actualidad se está investigando el papel de moléculas de adhesión como las integrinas, así como de otros componentes conocidos de las rutas de señalización de apoptosis como los receptores de muerte y las caspasas en la señalización de la anoikis.

Papel de la apoptosis en el sistema inmunitario
La muerte celular programada es muy importante para el desarrollo y funcionamiento del sistema inmunitario, debido a que interviene en los eventos de formación del repertorio de células T y B, en los mecanismos de tolerancia central y periférica, en la eliminación de células autorreactivas, en el establecimiento de la memoria inmunológica y en los mecanismos citolíticos de células asesinas naturales y linfocitos T citotóxicos.
Es conocido que el 95% de los timocitos son eliminados en el timo por mecanismos de apoptosis, proceso denominado selección negativa (deleción clonal), el cual elimina la existencia de clones T autorreactivos.

También en la médula ósea existe un proceso similar de deleción de clones B, autorreactivos en el estadio B inmaduro por entrecruzamiento de la inmunoglobulina de superficie en ausencia de señales coestimulatorias. No obstante, la apoptosis no se restringe a las células inmaduras.



FIGURA 1: Factores que regulan la ruta de las células T activadas, después del reencuentro con el Aq.

También los linfocitos T maduros, bajo ciertas condiciones, pueden sufrir apoptosis, lo que corrobora su papel inmunorregulador. Entre los factores que pueden inducir apoptosis en células maduras están: los glucocorticoides y las radiaciones gamma, la estimulación del complejo TCR/CD3 por anticuerpos monoclonales, Ags nominales y superantígenos y la estimulación de los receptores CD2, Fas/Apo-1 y TNF.

Se ha demostrado que la sensibilidad para lograr la apoptosis es más lenta en células maduras y requiere previa activación. La ruta que siguen los linfocitos T al ser estimulados depende de una serie de elementos que determinan si la célula prolifera, o si muere por apoptosis.

Mecanismos selectivos
Para asegurar el funcionamiento óptimo de algunos de los sistemas fisiológicos que componen los organismos superiores, deben existir procesos de selección celular. Estos están basados en mecanismos de generación de variedad celular en cuanto a su funcionalidad, seguidos de una selección de los mejores clones, normalmente en un ambiente de competencia. Estos fenómenos reproducen en el desarrollo del organismo, los procesos evolutivos que han dado lugar a la especialización y optimización de las especies. De la misma forma, consiguen una eficacia óptima de sus componentes así como una adaptación individualizada de cada organismo, en la que la participación del medio externo tiene gran importancia. Dentro de estros procesos de selección, la apoptosis juega un papel fundamental como herramienta para hacer desaparecer las células que no han sido seleccionadas.

Dos sistemas fisiológicos donde los fenómenos de selección son muy importantes son el nervioso y el inmune, precisamente sistemas entre cuyos objetivos se encuentran relacionar al organismo con su entorno y proporcionarle la mejor adaptación a el. Debido a la naturaleza de trabajo, el ejemplo de proceso de selección que se va a exponer a continuación pertenece al sistema inmune.

Selección negativa en timo
Este proceso que se lleva a cabo en el timo como etapa final de la maduración de los linfocitos T, tiene como objeto la eliminación, por apoptosis, de los clones de timocitos que hayan generado un receptor del linfocito T hacia el antígeno (TCR, de T cell receptor) con especificidad hacia un Ag propio. De esta forma se hace posible la autotolerancia en los organismos, es decir, la incapacidad de responder a un Ag propio y por lo tanto, de desencadenar procesos autoinmunes. En el timo tiene lugar la adquisición de tolerancia central hacia todos los Ag que puedan ser presentados por sus células, fundamentalmente proteínas ubicuas de membrana y suero.

Se diferencia de la tolerancia periférica adquirida en otras etapas de la ontogenia hacia Ag propios que solo pueden ser presentados en los tejidos periféricos. La selección de los clones T autorreactivos se lleva a cabo en la etapa de doble positividad de los timocitos (CD4+, CD8+). Estos se unen con alta afinidad al MHC que contiene péptidos propios y que es presentado por células presentadoras de Ag (APC) del timo. Esta unión de alta afinidad dispara en el timocito el programa de muerte por apoptosis. Se conoce poco acerca de los mecanismos moleculares que dirigen este proceso, pero parece ser muy importante en el, la presencia de las dos moléculas CD4 y CD8. Este proceso de selección negativa, junto al de eliminación de timocitos con reagrupamientos incorrectos en su TCR, parece ser responsable de la muerte del 95% de linfocitos T durante los procesos de maduración en timo (Nossal 1994, revisión del Cell).

I CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA APOPTOSIS
MODELO INICIAL: C. ELEGANS
- FAMILIAS DE MOLÉCULAS IMPLICADAS EN APOPTOSIS
- Receptores de muerte:
  > CD95 (APO-1/Fas)
  > TNFR1
  > DR3
  > DR4 y DR5
  > Proteínas de la familia Bcl-2
     Bcl-2
     Bcl-xL
     Bax
  > Miembros de la subfamilia BH3
- Proteínas de la familia de las caspasas
- REGULACIÓN MOLECULAR DEL PROCESO DE APOPTOSIS

Modelo inicial: C. elegans
Dentro del estudio del proceso de apoptosis que se ha venido realizando a lo largo de los últimos años, resultó determinante la descripción de los genes implicados en la maquinaria de apoptosis del nematodo caenorhabditis elegans (C. elegans) pertenece a un filo formado por:

"Gusanos de piel lisa, no segmentados, con un cuerpo alargado, cilíndrico y forma afilada en el extremo. Incluye formas libres y parásitas, ambas acuáticas y terrestres"

Es un organismo de aproximadamente 1mm de longitud, vive en el suelo sobre materia vegetal en descomposición, alimentándose de microorganismos. Su vida se prolonga a lo largo de 2-3 semanas durante las cuales se reproduce. El estudio de este nematodo fue iniciado en los años 60 por Sydney Brenner.

La ventaja que proporciona c. elegans como sistema experimental es que posee 959 células somáticas transparentes, que pueden ser estudiadas individualmente mediante microscopía, y 17800 genes diferentes que forman su mapa genético secuenciado íntegramente. Este organismo, a pesar de su simplicidad, desarrolla los procesos que en organismos superiores son motivo de estudio: embriogénesis, desarrollo, funcionamiento del sistema nervioso, comportamiento y envejecimiento. C. elegans representa el compromiso perfecto entre la simplicidad en su tratamiento y la complejidad de las funciones y los mecanismos que posee, regidas por genes que se han conservado a lo largo de la evolución hasta los mamíferos.

La apoptosis juega un importante papel en el desarrollo embrionario de c. elegans. A partir de los estudios que Horvitz inició en 1986 (Ellis, Cell 1996 mirar bibliografia Horvitz), se estableció el número y la localización de las células que morían por apoptosis durante el desarrollo y mediante el análisis de mutantes se describieron los genes implicados en este mecanismo. Estos genes se denominaron ced y se numeraron desde el -1 al -10. Ced-3. -4 y -9 regulan la fase ejecutora de la apoptosis y el resto está implicado en los procesos de eliminación por fagocitosis de la célula apoptótica. Posteriormente se describió el gen EGL-1 que participa también en la regulación de la MCP (Hengertner, Cell 1998).

El complejo ejecutor formado por ced-3, -4 y -9 representa la imagen más simplificada del programa apoptótico que se puede encontrar en células de mamíferos. Cada una de las proteínas expresadas a partir de ellos son equivalentes a las que, en organismos superiores, constituyen los pilares que soportan la red de señalización de la apoptosis. CED-3 es una proteasa equivalente a las caspasas de mamíferos, proteínas ejecutoras de la apoptosis que desmontan la maquinaria celular degradando un grupo seleccionado de proteínas. CED-3 se activa por homodimerización y para hacerlo posible, existe otra proteína CED-4 capaz de interaccionar con ella y también consigo misma.

La unión de CED-3 a CED-4 y la posterior homodimerización de esta, traería consigo la activación de CED-3. CED-4 tiene también su homologo en mamíferos, Apaf-1, que se une a procaspasa-9 y facilita su activación. La tercera proteína de esta maquinaria es CED-9, la pieza reguladora, que se une a CED-4 y la inhabilita para mediar la activación de CED-3, al impedir su homodimerización (28). Su interacción con una proteína pro-apoptótica como es EGL-1 en c. elegans, la separa de CED-4 dejándola realizar su función activadora de la apoptosis (Hengertner, Cell 1998). En mamíferos, esta proteína es equivalente a toda una familia con miembros tanto pro-apoptóticos como anti-apoptóticos que regulan el proceso de muerte celular. Las moléculas equivalentes entre los sistemas que se han mencionado anteriormente, presentan tal homología de secuencias que muestran que este sistema se ha mantenido totalmente conservado a lo largo de la evolución. Los componentes del sistema que parece que han sido de adquisición más recientes son los receptores de muertes, ya que ningún equivalente de ellos ha sido encontrado aún en c. elegans.

De esta forma, el estudio del nematodo c. elegans estableció las bases para la caracterización, que hoy día aún es incompleta, de la compleja red de procesos que culminan con la apoptosis celular y que a continuación se resumen.

Familias de moléculas implicadas en el proceso de apoptosis
Receptores de muerte

Las moléculas relacionadas con el proceso de apoptosis que se han mantenido a lo largo de la evolución, desde organismos como el c. elegans hasta los mamíferos, llevan a cabo un programa de apoptosis iniciado por señales que provienen del interior celular. Estas señales responden a eventos que comprometen el buen funcionamiento de la célula dentro del entorno donde está situada: perdida de contacto con las células que la rodean, estrés celular o señales contradictorias y simultáneas en cuanto a la puesta en marcha o no, de su ciclo de división. Ante esta situación, en que la célula es potencialmente peligrosa para el sistema donde se encuentra integrada, se pone en marcha la maquinaria de apoptosis y es eliminada.

Este sistema señalizador no puede sostener el tipo de apoptosis llamado "instructivo" en el cual a una célula que no ha sufrido ninguno de los daños mencionados anteriormente, se le dirige activamente hacia la apoptosis ya que su eliminación es necesaria para llevar a cabo determinado proceso fisiológico. Los mamíferos han desarrollado mecanismos para llevar a cabo esta forma de apoptosis que es especialmente importante dentro del sistema inmune. En la apoptosis "instructiva" tienen un papel fundamental los llamados receptores de muerte, situados en la superficie de la célula, y que reciben la señal de ligandos de muerte específicos para cada uno de ellos. Los receptores pueden dar la señal directamente a las caspasas en pocos segundos disparando así el programa de apoptosis.

Los receptores de muerte pertenecen a la superfamilia del receptor de TNF (TNFR) cuyos miembros tienen en común un dominio extracelular rico en cisteina. Otro rasgo común a todas estas moléculas señalizadoras de apoptosis es la presencia de una secuencia situada en su dominio intracitoplasmático y que serviría para acoplar al receptor con el resto de la maquinaría apoptótica. Los receptores de muerte mejor caracterizados son los siguientes:
· CD95 (APO-1/Fas)
Esta proteína fue identificada inicialmente mediante un Ac dirigido contra ella y que define un Ag presente en la superficie de células como linfocitos humanos B y T activados, algunas líneas tumorales de origen linfoide y otros tipos celulares como son los hepatocitos. El Ac contra CD95 se une a las células que lo expresan provocándoles apoptosis in vitro. Por otra parte, inyectando in vivo Ac anti-CD95 a ratones nu/nu con xenotransplantes de tumores humanos, eliminaban estos por apoptosis de sus células (Trauth, Science 1994). El gen que codifica para la proteína CD95 en humano se encuentra en la localización 10q23 (cromosoma 10) y consiste en una serie de 9 exones interrumpidos por 8 intrones. El dominio extracelular de la proteína está formado por tres subdominios ricos en cisteinas, codificados por los exones 2, 3 y 4, mientras que la zona intracitoplasmática, incluida la región reguladora llamada "death domain", se encuentra en el exón 9.

El ligando fisiológico de CD95 se denomina CD95L y es una proteína perteneciente a la familia del TNF (tumor necrosis factor). CD95 se expresa de forma bastante general en los distintos tejidos. La proteína ha podido ser detectada en células epiteliales, fibroblastos, osteoblastos y ciertos tipos de endoteliales, además en ratón, el ARNm de la proteína se ha detectado abundantemente en timo, corazón hígado y ovario. Por otra parte, CD95L se expresa predominantemente en células T y NK activadas, así como de forma constitutiva en los tejidos que gozan de "privilegio inmune". Este patrón de expresión de ambas moléculas demuestra que deben tener implicación en una serie importante de procesos fisiológicos relacionados con el sistema inmune.

Resulta importante a la hora de determinar el papel jugado por algunas moléculas, estudiar el efecto que tiene su pérdida de función en ratones "knockout". En el caso del par CD95/CD95L, existen ratones que portan las mutaciones homocigóticas lpr (lymphoproliferation) o gld (general lymphoproliferation disease), que se traducen por una perdida de función de los genes CD95 y CD95L respectivamente. Estos ratones presentan una serie de alteraciones como son linfoadenopatías y esplenomegalia por acumulación de células de origen T CD4- CD8-, niveles elevados de autoAc y desordenes de carácter autoinmune e inflamatorios. En el caso de las moléculas CD95/CD95L, existe también un referente humano de la perdida de su función, ya que se ha descrito en una serie de niños una mutación con carácter heterocigótico en el gen que codifica CD95. Esta mutación da lugar a un fenotipo similar al de los ratones lpr y gld, incluyendo linfoadenopatías, esplenomegalia, hipergammaglobulinemia y, de forma variable, una serie de alteraciones autoinmunes (Fisher, Cell 1995). Estos datos, tanto en ratón como en humano, han resultado de ayuda a la hora de establecer una serie de procesos fisiológicos en los que la implicación de la apoptosis mediada por la pareja de moléculas CD95/CD95L está perfectamente demostrada. Estos procesos son:

Modulación negativa de la respuesta inmune mediante la muerte por apoptosis de las células T activadas una vez realizada su función (Naga, Science 1995). De esta forma se evita su acumulación. También parece estar implicada en la delección de clones autorreactivos de linfocitos B.

Mecanismo efector de citotoxicidad por parte de linfocitos T y células NK. Se ha demostrado un papel importante de la apoptosis vía CD95 en la citotoxicidad mediada por células T y NK. Este mecanismo ocurre en unión al clásico, mediado por perforina /granzima B.

Existen órganos, como el ojo o testículos; cuya estructura no podría soportar los efectos de una respuesta inmune y su proceso inflamatorio asociado. Estos tejidos están aislados a estos procesos y se conocen como "sitios de privilegio inmune". Se pensaba que este "privilegio" se mantenía evitando la entrada de células activadas en ellos. Recientemente, se ha propuesto otro mecanismo de conservación del privilegio inmune. Las células activadas pueden entrar en estos tejidos pero, una vez allí, son eliminadas por apoptosis vía CD95 (Griffith, Science 1995). Esto se confirmó con el hallazgo de una expresión constitutiva de CD95L en el epitelio y endotelio de la cornea y el iris, en las células ciliares del ojo, así como en las células de Sertoli en el testículo, y con la observación de que, en ratones gld, se produce una inflamación masiva en la retina tras la infección con virus de herpes simple a diferencia de los ratones wild-type que no presentan apenas células inflamatorias.

· TNFR1
El receptor 1 de TNF es una proteína de aproximadamente 55 kDa y se expresa en la mayoría de los tipos celulares. Esta proteína da nombre a la familia en que está integrada, por tanto comparte con CD95 los tres subdominios ricos en cisteinas situados en la zona extracelular. El ligando de TNFR1 es TNF, una citoquina producida principalmente por macrófagos activados y células T en respuesta a infección. A diferencia de la pareja formada por CD95/ CD95L, el par TNFR1/TNF es capaz de trasmitir a la célula dos tipos de señales muy distintas entre sí. Por una parte, la unión de TNF a su receptor TNFR1 activa a los factores de transcripción NFkB y AP-1 dando lugar a la inducción de genes de carácter proinflamatorio e inmunomodulador. Por otra parte, esta unión puede dar lugar también a una señal de apoptosis. La señalización de apoptosis por medio de TNFR1 es mucho más limitada que la mediada por CD95. En el caso de TNFR1, la unión de su ligando solo señaliza apoptosis en algunos tipos celulares y solo cuando la síntesis de proteínas ha sido bloqueada. De este hecho se deduce que debe existir en las células algún factor que bloquee las señales de apoptosis derivadas de TNFR1. La expresión de este factor estará probablemente controlada a través de NFkB y JNK/AP-1.

· DR3
El receptor DR3 (death receptor 3) es muy parecido en cuanto a su secuencia, a TNFR1. Cuando se une a su ligando Apo3L, da lugar también a una doble señal que puede llevar a la activación de NFkB o a la muerte por apoptosis de la célula. Las moléculas que median ambas vías de la señalización son también las mismas que en el caso de TNFR. En el único aspecto en que existen diferencias entre ambas rutas de señalización es la expresión, tanto de receptores como de ligandos. El mensajero de Apo3L se encuentra expresado de forma constitutiva en muchos tejidos, mientras que DR3 se encuentra presente principalmente en bazo, timo y sangre periférica y se induce por la activación en linfocitos T. De forma inversa, es el receptor de TNF el que se encuentra expresado de forma ubicua mientras que el ligando se expresa solo en linfocitos y macrófagos activados. Esta diferencia sugiere distintas funciones biológicas para ambas vías señalizadoras.

· DR4 y DR5

DR4 y DR5 son receptores de muerte cuyo ligando llamado TRAIL o Apo2L es el que muestra mas similitud con CD95L aunque, a diferencia de estas molécula, su ARN mensajero se encuentra expresado de forma constitutiva en gran cantidad de tejidos y la expresión se eleva en linfocitos T se sangre periférica cuando estos son estimulados. La señal a través de Apo2L produce apoptosis en una gran variedad de líneas tumorales. Se ha descrito también en una subpoblación de células T maduras, un aumento de la apoptosis mediada por Apo2L al tratar estas con IL-2. Esto puede sugerir un posible papel de estos receptores en la delección periférica de los linfocitos T (Martínez Lorenzo, Eur. J. Immunol. in press). Otro posible papel de la apoptosis mediada por Apo2L es la eliminación de células infectadas por virus (Jeramias, Eur. J. Immunol. 1998).

La señal de apoptosis mediada por estos receptores puede ser regulada mediante una familia de receptores "decoy" (señuelos), DcRs, que protegen a la célula de la apoptosis provocada por la unión de TRAIL. Uno de los miembros de esta familia es DcR1 (TRID, TRAIL-R3 ó LIT), una proteína ligada a la superficie celular por una unión glicosil fosfatidil-inositol (GFI), que se asemeja a la porción extracelular de DR4 pero sin poseer ningún dominio intracitoplasmático. DcR1 es capaz de unirse a TRAIL y su transfección en células sensibles a esta vía de señalización reduce notablemente la apoptosis mediada por esta señal. DcR2 (TRAIL-R4 ó TRUNDD) es también un receptor homologo a DR4 y DR5 con el dominio intracitoplasmático truncado. Se ha demostrado que la transfección con DcR2 inhibe la apoptosis mediada por TRAIL de forma no activa, ya que la eliminación de su dominio interno no influye en su actividad inhibidora. Todos estos datos indican que, tanto DcR1 como DcR2 compiten con DR4 y DR5 por la unión de TRAIL, dificultando así que la señal de apoptosis sea transmitida a través de estos receptores.

Proteínas de la familia Bcl-2
Un proceso como la apoptosis, que culmina con la muerte de las células y que se cuenta con casi la totalidad de la maquinaria para llevarse a cabo ya sintetizada, a falta solo de la señal que la ponga en marcha, necesita de mecanismos de regulación de gran exactitud y seguridad. Una de las vías de regulación de la apoptosis más importantes es llevada a cabo por una familia de proteínas que cuenta en la actualidad con al menos 15 miembros en mamíferos y otros tantos en virus, y que tiene como característica, la homología de todos sus miembros con Bcl-2 que fue la primera que se describió. Las moléculas de esta familia tienen su equivalente en el sistema de c. elegans. Una de sus proteínas encargadas de llevar a cabo el programa de apoptosis, CED-9, muestra gran similitud tanto estructural como funcional con Bcl-2 impidiendo la activación de CED-3, efectora de la apoptosis, por CED-4.

La descripción del primer miembro conocido de la familia, Bcl-2, se realizó al estudiar el punto de corte en la translocación t(14:18), presente en el 85% de los linfomas foliculares de células B humanas. Esta translocación trasladaba un protoconcogen, al que se denominó bcl-2, desde su posición normal en 18q21 hasta el locus de la cadena pesada de la inmunología en 14q32. Esto colocaba a bcl-2 bajo las órdenes del promotor de la cadena pesada de inmunoglobulina, desregulando su trascripción y dando como resultado la sobreexpresión de Bcl-2 en las células de linfoma.

A partir de la descripción de esta proteína, tuvieron lugar otras muchas descripciones de moléculas que guardaban homología con esta y que tenían carácter anti o pro-apoptótico. Lo que identifica a todas estas proteínas como miembros de una sola familia es la presencia en su estructura de al menos una de cuatro secuencias consecutivas descritas y que se numeran desde BH1 a BH4. De estos dominios parece que BH3 está directamente relacionado con una función pro-apoptótica y el resto de ellos con una función anti-apoptótica. La estructura que presentan está también condicionada a la presencia de estos dominios. BH1, BH2 y BH3 forman una a-hélice cada uno de ellos y cuando están presentes en la misma moléculas, por ejemplo Bcl-x, pueden formar una hendidura hidrofóbica, en la cual podría encajar la a-hélice formada por el dominio BH3 si se encontrara en otra molécula de la familia orientado hacia el exterior.

Este dato estructural explica el importante papel que tiene en el funcionamiento de estas moléculas las homo y heterodimerizaciones, que tienen lugar ente ellas y que pueden dar lugar a su activación o inactivación. De esta forma, se crearía un equilibrio entre ellas en el que sería de vital importancia sus cantidades relativas. La heterodimerización no es necesaria para la actividad de los miembros anti-apoptóticos de la familia y para los pro-apoptóticos del grupo Bax. Sin embargo, es muy importante para los miembros pro-apoptóticos del grupo BH3 que basan gran parte de su funcionamiento en la unión a las proteínas anti-apoptóticas alterando su actividad. Los miembros más estudiados y que poseen una relación con el sistema inmune mejor establecida son los que se exponen a continuación:

· Bcl-2
Es la proteína prototipo de esta familia. Pesa 26 KDa y posee los cuatro dominios que la definen (BH1-BH4). Bcl-2 es una proteína integral de membrana y se encuentra en la cara citoplasmática de la membrana externa de la mitocondria, el retículo endoplásmico y la envuelta nuclear. Es en esas membranas, gracias a que puede formar una estructura similar a un poro, donde se desarrolla una de sus posibles funciones: modificar el flujo de moléculas o pequeñas proteínas a través de ellas, interviniendo en la estabilidad de orgánulos como la mitocondria ante la existencia de posibles daños. Su sobreexpresión puede evitar o al menos retrasar varias formas de muerte celular programada como las inducidas por retirada de factores de crecimiento, irradiación g, glucocorticoides y múltiples drogas quimioterápicas.

En contraste, parece no influir en otros mecanismos de apoptosis como, por ejemplo, la señalización vía CD95 en la mayoría de los tipos celulares. A la hora de establecer el papel fisiológico realizado por Bcl-2, debe estudiarse el fenotipo que presenta el ratón knockout para el gen que lo codifica. El animal se desarrolla normalmente pero termina mostrando una exagerada apoptosis de linfocitos y melanocitos, así como lesiones neuronales e intestinales y una enfermedad renal terminal. Esto lleva a pensar que Bcl-2 no tiene un papel muy importante, o al menos tiene un papel redundante, en el desarrollo embrionario pero, ya después, interviene en la regulación de la apoptosis en linfocitos, neuronas y el resto de células y tejidos mencionados anteriormente.

· Bcl-xL
Bcl-xL es una de las proteínas más estrechamente relacionada con Bcl-2, tanto en su estructura como en su función. Posee los cuatro dominios BH y su peso molecular es de 30 KDa. Su sobreexpresión puede mediar una resistencia significativa a la muerte celular por apoptosis dependiente de deprivación de factor de crecimiento. Se ha estudiado la expresión del ARNm de esta molécula y parece encontrarse en una gran variedad de tejidos entre los que destaca algunas poblaciones del sistema hematopoyético y el sistema nervioso central. Esta distribución preferencial puede sugerir algunos de los papeles fisiológicos que puede jugar la expresión de esta proteína.

La expresión del mensajero de esta molécula en tejido neural adulto es alta y constitutiva y esto puede estar relacionado con la capacidad de este tejido de mantener la viabilidad celular postmitótica durante largos periodos de tiempo. Un dato que hace importante a la molécula Bcl-xL en el contexto de este trabajo es que, dentro de la ontogenia de los linfocitos B, Bcl-xL se expresa en dos momentos muy concretos: uno es el estadio pre-B y otro es durante la estancia de las células en los CG, justo al mismo tiempo en que se produce una "downregulation" de Bcl-2. Estos datos acompañados de experimentos en que se estudia el efecto de la sobreexpresión de Bcl-xL sobre la respuesta inmune a nivel de órganos linfoides secundarios revelan un importante papel de la proteína Bcl-xL en estos territorios aunque no se ha podido establecer aún su mecanismo de acción. El ratón knockout para este gen es inviable lo que demuestra su enorme importancia también el desarrollo embrionario.
 
· Bax
Esta proteína es uno de los miembros pro-apoptóticos más importantes de la familia. Le da nombre a la subfamilia Bax, su peso molecular es de 21 KDa y posee los dominios BH1, BH2 y BH3 aunque son BH1 y BH2 los que guardan una estrecha homología con Bcl-2. Bax está ampliamente expresado en los distintos tejidos y su sobreexpresión acelera la muerte en respuesta a distintas señales. Lo que ha hecho recientemente a Bax objeto de estudio es su implicación en los fenómenos mitocondriales de la apoptosis y su capacidad de llevar a cabo una forma de muerte celular programada independiente de muchos de los mecanismos de regulación y ejecución de este proceso. Esto parece estar relacionado con su capacidad para interaccionar con los canales que controlan la permeabilidad y el flujo ionico en dicho orgánulo.

Miembros de la subfamilia BH3
Esta subfamilia está compuesta solo por miembros proapoptóticos que, excepto por el dominio BH3, no muestran homología con Bcl-2. Para ejercer su actividad, estas proteínas pueden formar heterodímeros con miembros antiapoptóticos de la familia. Para ello, el dominio BH3 de los miembros de este grupo puede introducirse en el hueco hidrofóbico formado por la asociación de las regiones BH1, BH2 y BH3 de los miembros antiapoptóticos. Un ejemplo de la acción de esta familia de proteina es la ejercen dos de sus miembros Bid y Bik sobre la mitocondria, donde inducen la liberación de citocromo c y posterior apoptosis (Shimizu, PNAS, 2000).

Proteínas de la familia de las caspasas
Dentro de la maquinaria que lleva a cabo el programa de apoptosis, los miembros ejecutores son una serie de proteasas englobadas bajo el nombre de caspasas. Este sistema ejecutor se ha mantenido a lo largo de la evolución y, tras su descripción en c. elegans, se encontró el equivalente en mamíferos gracias a la homología que presentaban ambas moléculas. Esta primera proteasa encontrada en mamífero se denominó ICE (interleukin-1b-converting enzime) o caspasa-1 (cisteina-aspartasa-1) y es precisamente uno de los pocos miembros de la familia al que no se le ha podido hallar relación directa con el proceso de apoptosis, sino más bien con el de la inflamación.

La familia de las caspasas en humanos está formada hasta el momento por 11 miembros descritos, y todos ellos tienen en común que se encuentran en forma de zimógeno o proenzima con una estructura bien definida: a) el dominio N-terminal es muy variable tanto en su secuencia como en su longitud y tiene funciones de regulación y activación, b) la región catalítica está formada por dos dominios, uno grande ("20 KDa) y otro pequeño ("10 KDa), que darán lugar a las dos subunidades del enzima una vez activada. Las caspasas se dividen en dos grupos según la longitud de su región reguladora N-terminal o prodominio. Las caspasas con prodominio largo como son la -1,-2, -4, -5, -8, y -10 parecen estar involucradas en funciones de regulación de la activación de la cascada.

Ejemplos bien conocidos de este grupo son las procaspasas -8 y -10 que contienen en sus largos prodominios repeticiones de una secuencia de interacción proteina-proteina llamada dominio efector de muerte o DED (death effector domain) y las procaspasas -1, -2, -4, -5 y -9, que contienen dominios de reclutamiento de caspasas o CARDs (caspase recruitment domains). La presencia en su estructura de estas secuencias unido a su localización cercana a la membrana plasmática hacen posible su reclutamiento hacia el complejo formado en torno a receptores de superficie señalizadores de apoptosis como CD95 y TNF, activándose allí y dando lugar al comienzo de la cascada de proteolisis. Por esta situación dentro del proceso se las conoce como caspasas iniciadoras. El otro grupo está compuesto por las caspasas con prodominio corto como son las caspasas -3, -6 y -7. Estas parecen estar situadas "downstream" en la cadena y se ha demostrado in vitro que son activadas por alguna de las caspasas iniciadoras. Los estudios realizados sugieren que estas caspasas llamadas efectoras son las que actúan al final de la cascada sobre los componentes celulares, proteolizándolos.

Las caspasas realizan su función enzimática de forma específica y eficaz. Cortan una cisteina precedida por un aspártico, cuando existe en el sustrato una secuencia de reconocimiento compuesta de cuatro aminoácidos y que varía significativamente entre las diferentes caspasas. Además, es necesario que la proteína sustrato posea también una estructura terciaria que le permita ser reconocida por las caspasas. A la hora de estudiar el papel de las caspasas en los distintos sistemas, se utilizan péptidos inhibidores sintéticos, que compiten con los sustratos fisiológicos por el sitio activo del enzima. Estos péptidos pueden ser específicos para bloquear la acción de una o varias caspasas o generales. También existe variabilidad en cuanto a la reversibilidad de su efecto.
El mecanismo de acción de las caspasas tiene importancia a la hora de explicar tanto su papel dentro de la apoptosis como su activación. Todas las caspasas se activan por proteolisis y cumplen todas las condiciones para que esta activación sea llevada a cabo por otras caspasas.

Una de estas moléculas activa a la otra cortando entre sus dominios. De esta forma, el prodominio se pierde y la enzima activa queda formada por un heterodímero compuesto por la subunidad grande y la subunidad pequeña. Ambas subunidades aportan al sitio activo residuos encargados tanto del reconocimiento de sustrato como de la catálisis. A la hora de actuar, las caspasas lo hacen en forma de tetrámero, dos unidades enzimáticas que se unen entre sí manteniendo ambos sitios activos independientes (55/5 o 6). Este proceso de activación puede permitir a las caspasas realizar su función con un efecto cascada que se va amplificando a si mismo desde que se da la señal de inicio. En cuanto a esto, se ha especulado mucho sobre como tiene lugar la señal que determina la primera autocatálisis activadora que disparará el sistema. Este sería además uno de los puntos donde podría establecerse una regulación del sistema.

Existe una hipótesis basada en la observación de que la sobreexpresión de determinadas procaspasas en la célula hace que estas se agrupen y se autoactiven. Esto sugiere que las caspasas iniciadoras podrían encontrarse como monómeros a bajas concentraciones y que la molécula adaptadora unida al receptor de muerte serviría para unirlas propiciando su autocatálisis. Existe también un modelo llamado "de autocatálisis facilitada" que postula que las caspasas se encuentran en la célula formando complejos o con una conformación tal, que previene su autocatálisis. Un cofactor actuaría facilitando la activación, bien cambiando la conformación de las misma, o bien liberando un inhibidor del complejo formado, de forma que se permitiese la autocatálisis de la proteína y el comienzo de la señal apoptótica.

En cuanto a los sustratos celulares sobre los que actúan las caspasas, estos son un número determinado de proteínas que son cortadas de manera coordinada con la finalidad de hacerles perder su función o modificársela, de tal manera, que la organización celular resulte desmantelada. La ruptura de sustratos por parte de las caspasas produce estos efectos en el proceso general:
- Llevan a cabo una degradación de moléculas implicadas en proteger a la célula del proceso de apoptosis como es el caso de ICAD/DFF45, la molécula que mantiene inhibida a CAD, la nucleasa responsable de la degradación del DNA durante la apoptosis. Otras moléculas protectoras de la célula y que son degradadas por caspasas son alguno de los miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2. En el caso de estas proteínas, la proteolisis libera un fragmento que tiene poder pro-apoptótico por si mismo. De esta forma, las caspasas realizan una alimentación positiva de su propio efecto.
- Degradan también moléculas implicadas directamente en la estructura celular como son la quinasa de adhesión focal o FAK (focal adhesion kinase) y la quinasa 2 activada por p21, modificando su actividad. En otras ocasiones, como en el caso de la gelsolina, la rotura por caspasa le hace perder la región reguladora pasando a expresarse de forma constitutiva.
- Otras proteínas degradadas por las caspasas son algunas de las relacionadas con la reparación en el ADN y con los procesos de replicación y transcripción del ADN (DNA-PKCS) o la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP). En este último caso, no está aún claro que objetivo persigue la ruptura de estos sustratos dentro del programa general de apoptosis.

Ante el gran número de caspasas que existen, aparentemente con funciones intercambiables, se plantea la cuestión de si existe una función redundante te todas ellas o si lo que ocurre, es que su actividad es específica de cada tejido. Experimentos con ratones knockout para varios miembros de las caspasas proporcionan una respuesta a esta pregunta, además de ilustrar sobre el papel fisiológico de estas proteasas. Estos estudios concluyen que existe una activación de las caspasas dependiente tanto del tejido como del estímulo desencadenante de la apoptosis.

Por último, la actividad de las caspasas va acompañada de la acción de sus inhibidores al igual que ocurre con otros sistemas proteolíticos. Se han identificado varios de estos inhibidores en virus. Los mejor estudiados son CrmA y p35. CrmA (cytokine response modifier A) es una molécula producida por el virus cowpox. Inhibe potencialmente las caspasas -1 y -8, y bloquea la apoptosis causada por TNF, CD95, la provocada por retirada de suero u otros factores de crecimiento, así como la que se origina tras romper las uniones de la células con la matriz extracelular. p35 es una proteína de baculovirus que bloquea principalmente la apoptosis producida por infección viral. Aunque estos inhibidores han sido encontrados solo en varios virus, existe una familia de proteínas inhibidoras de apoptosis (IAPs), alguno de cuyos componentes se han descrito ya en humanos. Se ha descrito in vitro una potente activación selectiva de caspasa-3 y-7 por parte de IAP, aunque el mecanismo de esta inhibición continua sin aclararse.

Regulación molecular del proceso de apoptosis
Hasta este momento se ha podido ver la descripción de los componentes más importantes de la maquinaria de apoptosis en mamífero, así como un pequeño esbozo de su función dentro del sistema. Dentro del proceso de apoptosis, todos estos elementos se encuentran coordinados entre sí, tanto física como funcionalmente y aportan al sistema global una gran variedad tanto de rutas de iniciación en respuesta a muy diferentes estímulos, como de puntos de regulación. En la vía señalizadora de apoptosis que, más que una forma lineal, presenta una estructura reticular muy ramificada en sus inicios y que después va confluyendo hacia rutas comunes para terminar en una o unas pocas, tienen especial importancia esos puntos de regulación.

Existen sobre todo algunos, situados al final dentro de la red, donde se deciden acciones tan drásticas para la integridad celular que constituyen auténticos puntos de no retorno.

A la hora de entender la interacción existente entre la señal de apoptosis y la puesta en marcha de la cascada de proteolisis mediada por caspasa, es necesario conocer la existencia de una serie de proteínas, los adaptadores. Entre estos adaptadores se encuentran FADD, TRADD y Apaf-1. FADD (Mort-1), es una proteína que sirve de puente entre CD95 y la procaspasa-8. Para ello posee dos regiones de unión que son las que distinguen a las moléculas adaptadoras. Por una parte, un dominio DD (death domain) por el cual se une a una región homologa presente en la región intracitoplasmática de CD95, y por la otra, un dominio DED (death effectot domain), ejemplo partículas del dominio CARD (caspase recruitment domain) de unión homotípica que poseen tanto las moléculas adaptadoras como las caspasas de prodominio largo y, que en este caso, le sirve para unirse a procaspasa-8. La perdida de FADD, estudiada mediante ratones knockout, es letal en la etapa embrionaria, lo que muestra que FADD debe tener otras funciones de señalización críticas, además de servir de puente entre CD95 y procaspasa-8. TRADD es el adaptador que se une mediante un dominio DD a la región intracitoplasmática de los receptores de superficie TNFR1 y DR3, y actúa como plataforma de emisión de varias señales, mediante su unión con otros adaptadores.

La unión de TRADD con FADD, también por la región DD, media la activación de procaspasa-8 como se vió anteriormente. Poe otra parte, TRADD puede unirse también al complejo ofrmado por RIP (que posee también dominio DD) y TRAF2, dirigiendo la señal hacia la activación de NF-kb. Por último, la proteína Apaf-1, homologa de la proteína de c. elegans.CED-4, actua como molécula adaptadora a nivel de mitocondria, uniendose a procaspasa-9 a través de un dominio CARD que posee en su extremo N-terminal. Apaf-1 tiene la capacidad de homodimerizarse, facilitando la agregación de la procaspasa como se vera a continuación. El papel de Apaf-1 es muy importante, como se demuestra en el efecto que su ausencia tiene en el ratón knockout, que muere durante la embriogénesis con graves alteraciones craneofaciales, sobrecrecimiento del cerebro y malformaciones en el ojo. El inicio de la señal de apoptosis puede encontrarse tanto fuera de la célula, en los receptores de superficie, como dentro de ella respondiendo a estímulos de estrés celular a nivel de mitocondria o a disfunciones dentro del ciclo celular.

Los receptores en la superficie de la célula como CD95 y TNFR1 dan comienzo a la señal de apoptosis realizando un reclutamiento de procaspasa-8. Para ello, interviene la molécula adaptadora FADD que en el caso de CD95 se une de forma directa y en el de TNFR1 lo hace a través de la molécula intermedia TRADD (TNFR-associated death domain). La proteína FADD contiene un dominio DED que recluta varia subunidades de procaspasa-8. TNFR1 puede dar lugar también a la activación de otras procaspasas mediante la unión de otras moléculas adaptadoras como son RAIDD y RIP2 que contienen regiones CARD, el otro dominio de interacción proteina-proteina que sirve para el reclutamiento de procaspasas. A partir de esta activación se desencadena el proceso. Otro punto de inicio de la señal de apoptosis es la mitocondria. Existe una molécula, Apaf-1, homologa en mamíferos de la proteína CED-4 de c. elegans, que puede unir procaspasa-9 mediante la interacción de sus regiones CARDs. Apaf-1 posee además otra región capaz de mediar su homodimerización y por tanto la unión de las procaspasas-9, lo que lleva a su autocatálisis y posterior activación. En todos estos sistemas, el complejo formado por los receptores, los adaptadores y la procaspasa se denomina apoptosoma, y es la formación de este complejo lo que da lugar a la activación de la procaspasa.

En el caso de Aaf-1, para llevar a cabo el proceso de formación de este apoptosoma es necesaria la presencia de ATP y de citocromo c, una molécula de pequeño tamaño liberada por la mitocondria. De esta forma, la liberación de citocromo c por parte de la mitocondria puede mediar la activación de la procaspasa-9. Esta señal de activación puede venir de la mitocondria en si misma como respuesta a distintas formas de estrés celular o también, puede formar parte de un bucle de amplificación de la señal mediada por receptores de superficie en la que interviene la mitocondria. En este bucle de amplificación interviene una proteína pro-apoptótica de la familia Bcl-2, Bid, que es procesada por caspasa-8 dividiéndose en dos fragmentos. Uno de ellos, el C-terminal, actúa sobre la mitocondria haciéndole liberar al exterior citocromo c, que activa el apoptosoma formado por Apaf-1 y procaspasa-9 llevándole a su procesamiento. De esta forma, en apoptosis mediada por receptor de muerte en las que existen pocos precursores de caspasa-8, la señal se amplifica mediante este sistema. Este punto de la red de señalización es susceptible a regulación por miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2, que actuarían inhibiendo el transporte de citocromo c al exterior y estabilizando la membrana mitocondrial.

Por eso la apoptosis mediada por receptor no se afecta por proteínas de la familia Bcl-2 excepto en los casos en que en esta ruta tiene gran peso la amplificación llevada a cabo por Bid en la mitocondria.

En cuanto a la señal de muerte que parte exclusivamente de la mitocondria, puede responder a una gran variedad de estímulos que impliquen estrés celular como son algunas drogas, radiaciones, agentes oxidantes, sobrecarga de Ca++, etc. Algunos de estos estímulos actúan directamente sobre la mitocondria y otros lo hacen a través de moléculas mediadoras como son las ceramidas, segundos mensajeros en la señalización de apoptosis y Bax, un miembro pro-apoptótico de la familia Bcl-2 muy importante en la apoptosis mediada por mitocondria.

Los efectos de estas señales en la mitocondria se traducen en una serie de alteraciones en el buen funcionamiento del orgánulo. Se produce una liberación de citocromo c, ruptura de la cadena de transporte de electrones, liberación de iones superoxido y una hiperpolarización de la membrana interna que puede terminar con una expansión de la matriz y ruptura de la membrana externa de la mitocondria. Otros efectos sobre la mitocondria son la inducción del poro mitocondrial que quedaría permanentemente abierto, permitiendo la entrada de agua y solutos en la matriz con el consiguiente choque osmótico, y la liberación del factor inductor de apoptosis (AIF), que se ha demostrado que procesa procaspasa-3 in vitro. También la activación de Bax que puede formar, como otros miembros de la familia Bcl-2, un canal en la membrana de la mitocondria que en su caso, en lugar de estabilizarla como ocurre con los miembros anti-apoptóticos de la familia, haría lo contrario.

Por último, existen señales de apoptosis que tienen su inicio en el núcleo y esto es debido a que, en el contexto de un organismo pluricelular, una célula que ha adquirido por daños en el ADN un carácter neoplásico debe ser eliminada por apoptosis, ya que la desaparición de una célula no supone ningún perjuicio al organismo y en cambio su transformación si. Existen en la célula mecanismos capaces de detectar daños en el ADN y discriminar entre las dos posibles respuestas celulares a estos daños. La reparación, que puede ser útil en el caso de células que se van a diferenciar de forma inminente perdiendo su capacidad mitótica (ej: células epiteliales), la apoptosis o la detención de la célula en los estadios G1 y G2 del ciclo, lo cual es una forma de muerte ya que la célula queda genéticamente inhabilitada de manera irreversible. Las respuestas celulares a daños genéticos están mediadas por quinasas, de las que cabe destacar dos: ATM y la quinasa dependiente de ADN, DNA-PK. Ambas dirigen una serie de respuestas entre las que se encuentran activación del ciclo, detención del crecimiento celular, reparación y apoptosis. ATM y posiblemente DNA-PK actúan sobre el factor de transcripción p53. Este factor se encuentra normalmente a bajos niveles ya que es degradado por la proteína Mdm-2. El daño en el ADN induce fosforilación de p53 o Mdm-2, en el caso de Mdm-2 posiblemente por DNA-PK. La fosforilación inhibe la interacción de ambas proteínas y por tanto p53 se estabiliza, incrementando su expresión y activándose.

La activación de p53 puede dar lugar a dos respuestas:
Detención en el ciclo celular de forma irreversible mediante la inducción de p21, un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina (Cdk).
Apoptosis mediante un mecanismo que aun permanece sin determinar pero en el que parece que influye la activación de genes como el de Bax y otras moléculas. Se han podido comprobar también otros mecanismos como transrepresión de genes anti-apoptóticos y otros mecanismos no transcripcionales.
Esta es la visión general de la red de eventos que rigen la apoptosis. Existen dentro de toda esta compleja red numerosos procesos aún por determinar, relaciones por establecer y mecanismos por entender dentro de un programa encaminado por igual a asegurar la vida de la célula y a procurar su muerte rápida y efectiva.

I EVENTOS CELULARES DEL PROCESO DE APOPTOSIS
CAMBIOS EN LA MEMBRANA PLASMÁTICA
- CAMBIOS EN LA MITOCONDRIA
- CAMBIOS NUCLEARES
- ELIMINACIÓN DE LA CÉLULA APOPTÓTICA

Cambios en la membrana plasmática
La membrana plasmática de la célula es uno de los lugares donde se hacen más evidentes los efectos de toda la serie de modificaciones bioquímicas que constituyen la apoptosis. Esto hace que la célula adquiera un aspecto típicamente apoptótico caracterizado por la disminución de tamaño, el aislamiento respecto de las células que la limitan (en el caso en que sea adherente) y el redondeamiento de su forma. Se generan también unas estructuras a modo de pequeñas evaginaciones esféricas surgidas a partir de la membrana, que se denominan blebs y que confieren a la célula un aspecto "boiling" (hirviente) al inicio del proceso y "pop-corn like" (forma de palomita de maíz) en los últimos estadios, cuando a los blebs se les han unido los cuerpos apoptóticos de tamaño mucho mayor y con contenido nuclear.

En las células apoptóticas se producen también cambios en la simetría de los fosfolípidos de membrana. Esto no se puede apreciar con la simple observación de la célula al microscopio, pero se puede detectar mediante técnicas de fluorescencia y, de hecho, resultan muy útiles a la hora de identificar poblaciones de células apoptóticas. La bicapa lipídica que forma la membrana plasmática de la célula tiene una composición y orientación muy determinada. Su distribución asimétrica se describió por primera vez hace 20 años (Bretcher, Nature 1972) y parece que este concepto se ha hecho extensivo a todos los tipos celulares de organismos eucariotas. De los fosfolípidos que forman la bicapa, los que contienen colina, esfingomielina y fosfatidilcolina, están orientados al exterior, mientras que la mayoría de los aminofosfolípidos, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, están orientados hacia el interior. Esta orientación de la membrana no es un hecho estático, sino que es fruto de una dinámica en la que continuamente los fosfolípidos se mueven cruzando la membrana en ambas direcciones hasta conseguir el equilibrio que garantice la correcta arquitectura. En la estabilidad de esta intervienen interacciones lípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína, así como la acción de tres enzimas: flipasa, flopasa y scramblasa, que median los movimientos de los fosfolípidos en una forma ATP y Calcio dependiente (234). La enzima flipasa transporta rápidamente los aminofosfolípidos (PS y PE) desde la membrana externa hacia la interna de una forma dependiente de ATP. La flopasa, otra enzima dependiente de ATP, transporta lentamente y de forma no especifica fosfolípidos de la membrana interna a la externa. Por último, la scramblasa se activa con un incremento del calcio intracelular y, de forma muy rápida, induce una aleatorización de la distribución de fosfolípidos.

Durante la apoptosis, ocurre una perdida de la asimetría de la membrana y por tanto una externalización de PS como uno de los eventos más precoces. Existe muy poca información sobre el mecanismo de esta alteración aunque puede que, por una parte, el aumento intracelular de Ca++ y, por otra, las alteraciones en los niveles de PIP2 que se dan durante la apoptosis ocasione un desacople de las enzimas encargadas de mantener la asimetría. Este evento es muy importante para el proceso general de la apoptosis ya que "marca" a las células para su posterior fagocitosis como se verá a continuación.
La otra alteración de la membrana asociada a apoptosis que es la formación de blebs, presenta también una gran cantidad de incógnitas en lo que se refiere a su mecanismo de formación. Es bien conocido que durante la apoptosis se produce una reorganización del citoesqueleto por la proteolisis de muchos de sus componentes y esto puede dar lugar a la formación de estas estructuras, de cuyo posible papel fisiológico trata parte de este trabajo.

Cambios en la mitocondria
Como se ha mostrado en apartados anteriores, la mitocondria juega un papel muy importante dentro del proceso de apoptosis. Su función amplificadora de la señal, iniciada por las caspasas, asegura la culminación del proceso incluso ante la existencia de un reducido número de moléculas de proenzima actuando como unidades iniciadoras. Así mismo aporta a la ruta ejecutora de la apoptosis un sitio de regulación mediante las proteínas de la familia Bcl-2. Finalmente, en ausencia de caspasas, como se ha demostrado en sistemas tratados con inhibidores de estas, es capaz de mediar por si sola una forma de muerte celular mucho mas lenta y de características atípicas cuya relevancia fisiológica se está estudiando.

Debido a esta fuerte implicación en el proceso, la mitocondria es uno de los orgánulos celulares que sufren numerosos cambios en su funcionamiento a lo largo de este. Estos cambios en su función no se corresponden con cambios morfológicos ya que la mitocondria mantiene su apariencia intacta durante prácticamente todo el proceso, a diferencia de lo que ocurre en la necrosis.

A nivel molecular, en la mitocondria se disparan mecanismos propios del programa de apoptosis, además de darse una serie de disfunciones en los procesos bioquímicos llevados a cabo en este orgánulo que pueden, por si mismos a largo plazo, conducir a la célula a la muerte. Estos mecanismos y disfunciones son:
- Se produce un desacople en la cadena de transporte de electrones así como una detención del metabolismo energético. Esta alteración se ha observado en apoptosis de timocitos producida por radiación g y en la apoptosis vía CD95. La ceramida, un segundo mensajero implicado en la señalización de apoptosis, provoca la detención de la cadena en un punto determinado, según se ha podido comprobar tanto en células como en mitocondria aislada. Como consecuencia de esto, se produce una caída en la producción de ATP, pero esto ocurre a largo plazo y no parece estar implicado en la inducción de apoptosis.

- Producción de especies reactivas de oxigeno. Dentro de la cadena de transporte electrónico se estima que entre un 1 y un 5% de los electrones se pierden participando principalmente en la formación de iones superoxido O2-. Al perder eficiencia la cadena de transporte durante la apoptosis, se incrementa la formación de estos radicales libres. Aunque la tardía formación de estas especies y el normal desarrollo de la muerte celular en condiciones de anaerobiosis cuestionan su necesidad dentro del proceso, no existen aún bases suficientemente consolidadas como para excluirlos de él.

- Liberación de citocromo c. Una gran variedad de agentes pro-apoptóticos inducen en la mitocondria la liberación de citocromo c. Esta molécula, cuya liberación es independiente de caspasas en la mayoría de los sistemas estudiados (hay que hacer la excepción de la liberación inducida por CD95) es una pieza imprescindible en el apoptosoma formado por Apaf-1 y procaspasa-9, y le lleva a su procesamiento hasta dar lugar a caspasa-9 activa. La liberación de citocromo c en respuesta a estímulos pro-apoptóticos se inhibe por la presencia de Bcl-2.

- Fallo en el mantenimiento del potencial transmembrana. El potencial mitocondrial transmembrana proporciona una distribución asimétrica de protones y otros iones en ambas caras de la membrana interna de la mitocondria, dando lugar a un gradiente tanto químico como eléctrico. Durante la apoptosis se ha observado una ruptura de este potencial como rasgo muy temprano. La causa de esta reducción del potencial transmembrana se produce por la apertura de un gran canal llamado poro de transición de permeabilidad (PT) mitocondrial. Este poro está formado por proteínas de la membrana interna, como el translocador de nucleótido adenina (ANT) y de la membrana externa, como la porina o canal aniónico voltaje dependiente (VDAC). Los componentes de ambas membranas se acoplan entre sí constituyendo un punto de contacto entre ambas membranas a través del cual pueden pasar moléculas de peso = 1,5 KDa. Su función fisiológica, según está en estudio, es permitir la liberación de Calcio al citoplasma y la entrada de proteínas importantes para mantener el potencial transmembrana hacia la matriz mitocondrial, todo esto mediante breves pulsos de apertura. El hecho de que algunos estímulos inhibidores de apoptosis actúan sobre el poro, impidiendo su apertura, hace pensar que pueda tener un papel en el proceso de apoptosis. El lugar del poro PT dentro del programa de ejecución de la apoptosis parece estar "downstream", tanto de la liberación de citocromo c como de la activación de las caspasas. En cambio, tanto las caspasas como la proteína Bax si parecen facilitar su apertura permanente, lo que induciría una nueva liberación de citocromo c y de un factor pro-apoptótico mitocondrial (AIF) que a su vez inducirían activación de caspasas. Esto sitúa al poro PT como lugar de amplificación de la señal de apoptosis. Independientemente de estos efectos, la apertura del poro PT puede dar lugar a una desregulación del volumen de la mitocondria por hiperosmolaridad en la matriz. Esto la llevaría a expandirse hasta romper la membrana externa con la consiguiente liberación del contenido del espacio intermembrana al citosol.

- Formación de poros por las proteínas de la familia Bcl-2. Como se expuso en el apartado anterior, la mayoría de los mecanismos apoptóticos que tienen lugar en la mitocondria están regulados por el equilibrio entre los miembros de la familia Bcl-2. Uno de los mecanismos de regulación de esta familia se basa en la formación de poros en la membrana. Por eso, a todas las alteraciones adquiridas por la mitocondria enumeradas hasta ahora, hay que añadir la acción reguladora de estas proteínas.

Cambios nucleares
El aspecto del núcleo de una célula apoptótica se convierte en lo más característico de esta. Aunque existen variaciones entre los distintos tipos celulares, en general se produce un aumento en la densidad de la cromatina que comienza formando parches alrededor de la envuelta nuclear y terminan dando lugar a una o varias esferas densas en las últimas etapas. Los cambios iniciales se acompañan de una reducción del núcleo. Esta alteración en la cromatina es fruto de la ruptura de la lámina nuclear, estructura que se encuentra bajo la envuelta nuclear, y que participa en su estabilidad. Además de estos cambios morfológicos, en el núcleo celular se produce durante la apoptosis, la fragmentación del ADN en una escalera de subunidades regulares que resultan del corte al azar entre los nucleosomas, Llegan a sumarse hasta un millón de cortes dando como consecuencia una situación en la que la transcripción se para, ya que no existe forma de ser reparada. Se conoce muy poco sobre el papel que este fenómeno puede jugar dentro del proceso global de la apoptosis.

La ruptura del ADN es llevada a cabo por una endonucleasa que se activa vía caspasas. Esta endonucleasa fue primero descrita en ratón y se la denominó CAD (caspase-activated dexyribonuclease). Esta enzima se encuentra normalmente en el citoplasma de forma inactiva, por efecto del inhibidor ICAD que posee sitios de corte por caspasa-3. Durante el proceso de apoptosis, ICAD es degradado por la caspasa-3 y esto libera y permite la activación de la nucleasa CAD, que realiza su función sobre el núcleo de la célula. En humano existe un sistema homólogo al descrito en ratón. Existe una proteína humana, DFF45 (DNA fragmentation factor 45), que presenta una secuencia significativamente similar a la de ICAD y que media también fragmentación del ADN en núcleos cuando se produce activación de la caspasa-3. De esta forma, se supone que DFF45 actúa en humanos sobre una nucleasa similar a CAD inhibiéndola igual que ocurre en ratón. Aunque los efectos de la endonucleasa sobre el ADN celular sean tan drásticos, estudios realizados induciendo apoptosis en células con un inhibidor ICAD mutante resistente a caspasas, demuestran que la célula muere por apoptosis en ausencia de fragmentación del ADN. Esta muerte se traduce en ruptura de sustratos en el citoplasma, alteraciones típicas en la membrana plasmática, en la integridad de la mitocondria etc. Todo esto conduce a la muerte de la célula que mantiene su ADN integro, aunque la cromatina si presenta las alteraciones típicas de apoptosis, probablemente por la acción de caspasas sobre proteínas nucleares como son poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) o lámina nuclear. Este hecho permite replantear la degradación del ADN en el proceso de apoptosis, no como medio de destrucción de la célula (que llega a morir igualmente en ausencia de fragmentación del ADN) sino como parte del proceso de limpieza de las células muertas, facilitando su fagocitosis o previniendo que el ADN integro pueda transformar a la célula fagocítica.

Eliminación de la célula apoptótica
En el proceso de apoptosis, tan importante es que la muerte sea rápida, efectiva y sometida a buenos procesos de regulación como que, una vez muerta, la célula sea convenientemente retirada. De esta manera se evita su ruptura y el vertido de su contenido al medio, lo que daría lugar a una respuesta inflamatoria indeseable. Estudios realizados en c. elegans describen la existencia de 7 genes implicados en el aclaramiento de las células apoptóticas, lo que demuestra la importancia que este proceso tiene en la apoptosis.

En general, existen dos estrategias para este proceso: a) en tejidos con bajos índices de apoptosis, la fagocitosis es ejercida por células vecinas; b) en ciertos tejidos con altas tasas de apoptosis, existen células "profesionales" (generalmente macrófagos) que hacen esta función. Uno de los puntos más importantes en el estudio de este tema es la descripción de los mecanismos de reconocimiento de la célula apoptótica por parte de los fagocitos o las células vecinas encargadas de su eliminación. Existen ya varios de estos mecanismos identificados. Estos incluyen tanto sistemas de reconocimiento por parte de los fagocitos, como sistemas de señalización de su estado por parte de las células apoptóticas. El primer mecanismo descrito implica a uno de los sistemas de interacción célula-célula más familiares: los carbohidratos de superficie de una célula se unen a las lectinas de otra célula.

Este sistema fue considerado a partir de la observación de que al añadir un azúcar, reconocida por determinada lectina de la superficie celular, como es N acetil glucosamina, se reduce en un 50% respecto al control, la unión de macrófagos peritoneales de ratón a timocitos apoptóticos, sin afectar su unión basal a timocitos no apoptóticos. Esta acción se demostró que era específica de determinadas lectinas, ya que solo algunos azucares tenían propiedades inhibidoras. A partir de estos datos se estableció que la apoptosis provocaba cambios en los carbohidratos de la superficie celular que lo hacían reconocibles por algunas lectinas. Para confirmar esta hipótesis, experimentos de microelectroforesis celular demostraron que existía una perdida en la superficie celular de cargas negativas y todos estos datos en conjunto permitieron confeccionar el siguiente modelo:
La perdida de residuos terminales de ácido siálico de las cadenas laterales de las glicoproteínas por parte de las células apoptóticas, expone residuos normalmente enmascarados por ellas, que interaccionan con las lectinas de la superficie de macrófagos.

El segundo mecanismo se describió a partir de estudios de inhibición dependiente de carga eléctrica, del reconocimiento de células apoptóticas. Estos hicieron suponer la presencia de una estructura en la superficie de estas células, capaz de interaccionar con los fagocitos. Esta estructura no presentaba carácter proteico, ya que su acción no se inhibía por proteasas ni por inhibidores de su síntesis. A partir de los estudios de inhibición, se identificó también un posible receptor presente en los fagocitos, la integrina a4b3 a la que se atribuían previamente solo funciones de adhesión a matriz. Trabajos posteriores confirmaron el papel de esta molécula en diferentes sistemas experimentales. En la interacción de esta proteína con la célula apoptótica interviene una molécula puente, la trombospondina, que es secretada y sintetizada por los macrófagos y sirve de puente al unirse al complejo formado por a4b3 y CD36 en el fagocito y a una estructura aún por determinar en la célula apoptótica.

El tercer mecanismo de reconocimiento responde al evento que ocurre en la membrana plasmática de las células apoptóticas, y que ha sido descrito en un apartado anterior: La perdida de la asimetría de fosfolípidos. Esta provoca la exposición al exterior de la fosfatidilserina (PS). La inhibición de reconocimiento en ciertos sistemas mediante la adición de liposomas que contenían PS en su superficie sugirió una posible interacción de la PS en la superficie de la célula apoptótica con un receptor en el macrófagos. Esto ha sido confirmado por estudios posteriores.
Todos estos mecanismos intervienen en el aclaramiento de células apoptóticas. El funcionamiento de uno u otro depende de la especie y de la naturaleza, tanto de la célula apoptótica como del fagocito. En al caso de fagocitos "profesionales", existe además el interrogante de que estímulos quimiotácticos intervienen para atraer a dicha célula hacia el foco donde tiene lugar la apoptosis.




La apoptosis es una función biológica muy importante en la patogenia de varias enfermedades estudiadas hasta el momento. Podemos destacar el cáncer, malformaciones, trastornos metabólicos, neuropatías, lesiones miocárdicas y trastornos del sistema inmunitario.

Respecto del cáncer, el factor biológico más importante antineoplásico parece ser la proteína 53 sintetizada por el gen humano p53. Es una fosfoproteína proapoptósica que se activa ente la presencia de mutaciones del ADN, actuando en la fase G1 del ciclo celular. Controla la reparación de lesiones del ADN efectuado por polimerasas específicas, (contribuye a frenar el ciclo en tales circunstancias) y es capaz de detectar células neoplásicas agresivas frenando su capacidad de producir angiogénesis para facilitar las metástasis. La p53 se agota rápidamente por lo que debe ser sintetizada en forma constante. Su rol es frenar el ciclo destruyendo células mediante la apoptosis antes de llegar a la etapa de síntesis a fin de impedir que se repliquen mutaciones carcinogenéticas, que producirán nuevas cepas tumorales cada vez más agresivas.

Otro aspecto de importancia clínica es la relación entre apoptosis y neuropatías. En el desarrollo del sistema nervioso, las neuronas se generan a partir de células precursoras que una vez diferenciadas no se dividen más. Antes de emitir dendritas y axones, las neuronas inmaduras o las precursoras emigran desde el lugar de nacimiento en busca de la localización definitiva usando como camino el sistema glial. Esta migración tiene, además, como objetivo lograr las conexiones interneuronales correctas. Si ello no se efectúa la neurona no recibe la acción de factores de crecimiento secretados por la célula receptora a que pertenece el axón conectado y la célula que hizo la conexión equivocada muere por apoptosis. Cualitativamente, en estudios realizados en la formación de la vía óptica en la rata, por oligodendrocitos que milienizan axones, mueren por apoptosis alrededor del 50% de ellos debido a conexiones erróneas. De esta manera contribuye la apoptosis en el desarrollo correcto del sistema nervioso.

Otro hecho de importancia observado recientemente es el rol que juegan la isquemia e hipoxia. En zonas periféricas de infartos cerebrales se han observado células en apoptosis con fragmentación de la cromatina y sobreexpresión de caspasas.

En enfermedades neurodegenerativas se ha observado apoptosis en biopsias de pacientes con Alzheimer, Huntington y Parkinson, fallecidos por otra causa. La apoptosis en la Enfermedad de Alzheimer no es sistematizada, sino difusa, que coincide con el polímorfismo de la lesión. Cotman en 1998 ha detectado que el Alzheimer muestra mayor número de células apoptósicas, especialmente en neuronas del hipocampo. Se ha postulado que estas lesiones puedan deberse a un descontrol genético de la apoptosis. El bloqueo de caspasas para frenar la apoptosis abre nuevos campos terapéuticos en enfermedades neurodegenerativas.

En cardiopatías, James en 1998 ha planteado que la apoptosis es importante en la destrucción exagerada de células durante el desarrollo del sistema excitoconductor produciendo trastornos como la bradicardia sinusal, arritmias graves y síndrome Q-T prolongado, en niños. Trastornos de oxigenación producen además de necrosis, cierta cantidad de apoptosis en partes periféricas de la zona dañada.

En infartos recientes se ha encontrado sobre expresión de Bcl 2. En infartos antiguos, con células en apoptosis, se ha detectado presencia de Bax (que ya vimos, es una proteína proapoptósica de la familia del Bcl 2 fosforilada). Dos autores sugieren que la insuficiencia cardíaca postinfarto sea debida en gran medida a la pérdida de cardiocitos por apoptosis.

CONCLUSIONES
- En todo organismo multicelular adulto debe existir un equilibrio entre la generación o proliferación y la desaparición o muerte de las células que lo componen, con el fin de mantener un tamaño constante.
- La alteración de este equilibrio conduce a situaciones patológicas como el cáncer, cuando la proliferación se encuentra aumentada, o las enfermedades degenerativas, cuando los procesos de muerte celular están incrementados.
- Es por ello que la apoptosis resulta esencial para toda forma de vida. Es un proceso clave para el desarrollo y es una medida de seguridad en la edad adulta. A medida que un organismo se desarrolla, enfrenta una serie de desafíos que surgen de su complejidad y de su entorno: debe producir muchos tipos de células diferentes a partir de una sola célula y debe coordinar las actividades de estas células diferentes permitiéndoles comunicarse entre sí. Cada célula debe trabajar para el bien común.
- Existen ocasiones, en que esto último significa que una célula debe suicidarse. Tales sacrificios ocurren en una forma ordenada. Las células que sufren lesiones mueren de forma desordenada: se hinchan, estallan, derraman su contenido sobre sus vecinas y producen inflamación; las que cometen suicidio mueren prolijamente y desaparecen. Sus muertes son útiles pues ayudan a esculpir el cuerpo y a mantener el correcto funcionamiento de otras células.

BIBLIOGRAFÍA
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3. Arango, María del Carmen y col. TEMA DE REVISIÓN. La apoptosis: sus características y su papel en la transformación maligna de la célula. Instituto de Oncología de Cuba. 1997.http://www.bvs.sld.cu/revista/onc/vol13_2_97/onc11297.htm
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5. Gewies, Andreas. Introduction to Apoptosis. ApoReview. Apoptopedia. 2003 En: http://www.celldeath.de/encyclo/index.html

6. Imágenes en http://www.copewithcytokines.de/cope-cgi?000638
7. Jarpa Orrego, Santiago. Apoptosis (muerte celular programada) Conferencia presentada en sesión del 2 de junio de 1999. Universidad de Chile.
http://www.uchile.cl/instituto/medicina/boletin/boletin36/conf4.html
8. Kimball, John W. Apoptosis Page. http://www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Apoptosis.html
9. La mitocondria.Muerte celular: historia de su investigación.Un accidente con consecuencias fatales En: www.cecs.cl/web/cecs_ index.php?area=educacion...
10. NASA. Cell Apoptosis. http://205.149.4.69/spacebio.net/modules/gs_resource/ Apoptosis.jpeg
11. Pines, Maya. Ventajas de suicidio celular. Como la apoptosis es saludable. Howard Hughes Medical Institute. 2005. En: http://www.hhmi.org/genesweshare-esp/c110.html
12. Señales de la apoptosis. En: sonhouse.hunter.cuny.edu/ foster/350-Syl-2003.htm

ANEXOS

- ANEXO 1:


En: Joaquín Jordán. Apoptosis: muerte celular programada. Ámbito farmacéutico. Bioquímica. Vol. 22, No. 6, Junio 2003.

- ANEXO 2: Imagenenes



Imágenen en: www.copewithcytokines.de/ cope.cgi?000638



Existen dos tipos de muerte celular: la apoptosis, propiamente tal, que sigue un programa, y la necrosis, que es accidental.
En: Muerte celular: historia de su investigación www.cecs.cl/web/cecs_ index.php?area=educacion...

La mitocondria
Considerada como la central de energía celular, la mitocondria es el organelo en la célula donde se lleva a cabo la respiración celular. Se sabe también que tiene un papel central en la apoptosis o muerte celular. Hay un interés creciente en oncología para entender como opera este vínculo mitocondrial con la apoptosis que, en condiciones normales, impide el desarrollo de tumores.


En la figura, mitocondrias en un tejido muscular. La mitocondria dispone de la energía mediante la síntesis de ATP, una verdadera moneda energética celular, porque participa en todas las transacciones de energía.
En: La mitocondria. www.cecs.cl/web/cecs_ index.php?area=educacion...

Apoptosis celular
La célula que está muriendo mediante apoptosis, o suicidio celular, sufre cambios notables. Primero se encoge y se separa de sus vecinas (parte superior derecha). Entonces aparecen burbujas o ampollitas (esferas rosadas) en su superficie (dándole apariencia de que bulle) y la cromatina (porción negra de la célula interior mayor), que es el ADN nuclear en complejos con proteínas, se condensa en los bordes del núcleo. Pronto el núcleo, y a continuación la propia célula, se rompe y los fragmentos celulares son rápidamente ingeridos por otras células en los alrededores.
En: NASA http://205.149.4.69/spacebio.net/modules/gs_resource/Apoptosis.jpeg



Apoptosis network





En: bio.ifom-firc.it/.../ doc/doc/maps/apoptosis.html

Los mecanismos de la apoptosis





En: John W. Kimball's Apoptosis Page http://www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Apoptosis.html


Apoptosis (muerte celular programada): Una vía versátil para el desarrollo terapéutico



Las mutaciones que ocurren en las células cancerosas frecuentemente hacen inefectivas las diversas vías apoptóticas con que cuenta el organismo y que están diseñadas para eliminar células malignas. Por esto, las terapias que puedan inducir la apoptosis en células cancerosas tienen gran potencial en el tratamiento de diversos tipos de cáncer.

En: www.biooncology.com/ bioonc/approach/apoptosis_image.m


Señales de la apoptosis



DATOS DE AUTORES
Lic. Mailin Borroto Castellano. Profesor instructor . Residente de Fisiologia Normal y Patológica.
Dr. Esmir Camps Calzadilla. Profesor instructor . Especialista en Fisiologia Normal y Patológica.
Institución: Laboratorio de Fisiología Digestiva Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas “Victoria de Girón”. Instituto Superior de Ciencias Médicas de la Habana. Cuba.
Siglas: ICBP “Victoria de Girón”
Organismo: Ministerio de Salud Pública
Dirección: Calle 146 y Esq. 31 No 3102, Reparto Cubanacán, Playa
Teléfono: 2719498.
Email: esmir.camps@infomed.sld.cu



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