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Conservacion de bacterias por el metodo de suspension en agua destilada esteril

Resumen: En una Coleccion de microorganismos todos los microorganismos depositados son muy valiosos, por lo que su correcta conservacion es muy importante. El metodo de conservacion en agua destilada esteril es muy facil y economico, por lo que el objetivo del trabajo, fue su utilizacion en la conservacion de diferentes generos bacterianos presentes en la Coleccion del Microorganismos del Instituto Nacional de Investigaciones de la Cana de Azucar (INICA).

Publicación enviada por M Sc. Juana Pérez Pérez y Otros Autores




 


Indice
Resumen
Abstract
Introducción
Materiales y Métodos
Cepas y medios de cultivo utilizado dos en el estudio
Metodología de Conservación
Evaluación de la supervivencia de las cepas
Resultados y discusión 
Conclusiones 
Recomendaciones

Resumen
En una Colección de microorganismos todos los microorganismos depositados son muy valiosos, por lo que su correcta conservación es muy importante. El método de conservación en agua destilada estéril es muy fácil y económico, por lo que el objetivo del trabajo, fue su utilización en la conservación de diferentes géneros bacterianos presentes en la Colección del Microorganismos del Instituto Nacional de Investigaciones de la Caña de Azúcar (INICA). Veinte cepas de los géneros Azospirillum, Azotobacter, Xanthomonas, Bradyrhizobium, Xynorhizobium y Gluconacetobacter diazotrophicus, fueron multiplicados en sus medios específicos, inoculados en frascos con agua destilada estéril, mantenidos a temperatura ambiente y en condiciones de refrigeración (4oC) y su viabilidad evaluada al año. Los porcentajes de supervivencia medios alcanzados a temperatura ambiente (76.0%), fueron superiores a los alcanzados en condiciones de refrigeración (54,7%), Los géneros Xanthomonas, Bradyrhizobium, Xynorhizobium alcanzaron valores de superiores tanto a temperatura ambiente, 90%, como en condiciones de refrigeración 70%. En general las cepas alcanzaron un 65% de supervivencia a través de este método. Aunque estos resultados no resultan totalmente satisfactorios para todos los géneros estudiados, debido a su facilidad y bajo costo recomendamos su utilización (en combinación con otros), para la preservación de bacterias por períodos de tiempo no muy extensos y a temperatura ambiente. Además recomendamos extender el estudio por un período más largo de tiempo. 

Abstract 
In a Culture Collection all the microorganisms deposited are very valuable, so its correct preservation is very important. The conservation method in sterile distillated water is very easy and economic, so the aim of this work was to use in the preservation of different bacterial genera, present at INICA´S Culture Collection. Twenty strains from de genera Azospirillum, Azotobacter, Xanthomonas, Bradyrhizobium, Xynorhizobium and Gluconacetobacter diazotrophicus were multiply in its specifics media, inoculated in bottles with distillated water, keeping at room temperature and in refrigeration (4oC) conditions and its viability evaluated at the year. The results shows highers surviving mean percentages at room temperature (76.0 %) than in refrigeration (54.7 %), thought Xanthomonas, Bradyrhizobium, Xynorhizobium genera reach highers values of 90 % and 70 % at room temperature and in refrigeration respectively. In general the strains hold a 65 % of surviving for this method. Although these results are not very satisfactory for all the genera, because the facility and low cost of the method, we recommend its use (in combination with others), for bacteria preservation for not longer periods of times, at room temperature. Morever we recommend to and to keep on its evaluation for more time. 

Introducción
Los microorganismos son las más numerosas y antiguas entidades bióticas que existen, logrando colonizar exitosamente cada nicho ecológico sobre el planeta, incluso en lugares en los que no ha sido posible localizar otras formas de vida, además su presencia y actividad son esenciales para la salud y el funcionamiento de los ecosistemas a través de todo el medio ambiente (Olembo, 1991). Su explotación y conservación de con fines investigativos es del interés de todo centro de investigación, pues permite disponer de cepas confiables cuando estas sean solicitadas, por lo que resulta de mucha importancia el empleo de técnicas que permitan el mantenimiento y preservación de los microorganismos por largos períodos de tiempo (Weng et al., 2003; Pérez, 2004).

Existen diferentes métodos para la preservación de los microorganismos y todos tienen ventajas y desventajas, por lo tanto el método escogido debe ser el que mejor se adecue a las necesidades de la colección, teniendo en cuenta la competencia técnica, los recursos financieros y las facilidades disponibles (García y Uruburu, 2000) y recordando siempre que no existe un método universal para la preservación adecuada de todos los microorganismos (García y Uruburu, 2000; Castro et al., 2000; Smith et al., 2000). 

Para la correcta conservación de las cepas se deben cumplir tres objetivos fundamentales que, en primer lugar que el cultivo a conservar esté puro, en segundo que se logre una supervivencia de al menos el 70-80% de las células, o sea que sean viables y en tercero que sean genéticamente estables. 

Para su mejor comprensión estos métodos pueden ser agrupados en: métodos de elección o de conservación a largo plazo (son los mejores, ya que garantizan al máximo la estabilidad genética, a él pertenecen los métodos de congelación y la liofilización), métodos alternativos (se utilizan cuando no pueden ser utilizados los anteriores, ellos incluyen la transferencia periódica y la conservación en agua destilada estéril) y métodos restringidos (se utilizan para grupos de microorganismos muy específicos que no resisten los métodos de elección, a el pertenecen la desecación en papel de filtro, en bolitas de alginato, en suelo, etc) (García y Urubura, 2000). 

La conservación en agua destilada estéril es un método alternativo muy utilizado, pues se obtienen altos porcentajes de viabilidad en hongos filamentosos (Smith, 1994; Bueno y Gallardo, 1998), levaduras (Kirsop, 1991; Mateos, 2002) y algunas bacterias (García y Uruburu, 2000), en períodos de tiempo que en muchas ocasiones superan los 5 años, observándose además una buena estabilidad de los caracteres morfológicos y fisiológicos (Bueno y Gallardo, 1998; García Uruburu, 2000;).

El Instituto Nacional de Investigaciones de la Caña de Azúcar cuenta con una importante Colección de Microorganismos de interés para la caña de azúcar, entre los que se encuentran diferentes géneros de hongos y bacterias, por lo que el objetivo de este trabajo fue evaluar la conservación de diferentes géneros bacterianos presentes en la colección mediante el método alternativo de suspensión en agua destilada estéril.

Materiales y Métodos
Cepas y medios de cultivo utilizados en el estudio 

En la tabla 1, aparecen relacionadas las 20 cepas de los diferentes géneros bacterianos utilizadas en el estudio, las cuales procedes de la Colección de Cultivos Microbianos del Instituto Nacional de Investigaciones de la Caña de Azúcar (INICA) de Cuba. 

Tabla 1. Cepas de las diferentes especies bacterianas empleadas en el estudio


Para la preparación de los inóculos, las cepas de los diferentes géneros fueron crecidas en los medios específicos descritos en la literatura (tabla 2) e incubados a las temperaturas óptimas para cada género. El interés económico de su conservación, se refiere a las características de 

Tabla 2. Medios de Cultivos empleados para los diferentes géneros bacterianos utilizados en el estudio


Metodología de Conservación
Después de crecidas las cepas, se tomaron alícuotas de 50 µL que contenían una concentración celular de 105 cel.mL-1, con los que se inocularon frascos pequeños de 20 mL de volumen total, que contenían 10 mL de agua destilada estéril. Estos frascos fueron previamente esterilizados durante 20 minutos a 1 atmósfera de presión, empleando primeramente tapones de gasa, los que fueron reemplazados por tapones de goma una vez inoculados. Cada cepa fue replicada 8 veces, siendo la mitad de los frascos fueron mantenidos a temperatura ambiente y la otra en refrigeración (4oC) durante 12 meses.

Evaluación de la supervivencia de las cepas
La efectividad del método empleado, se determinó evaluando la supervivencia de las cepas a los 6 (datos no mostrados) y 12 meses, a través de la siembra de las mismas en los diferentes medios de cultivo específicos para cada género, cada muestra se sembró por triplicado, considerándose viable el cultivo cuando hubo crecimiento típico del microorganismo. Se calcularon los porcentajes de viabilidad y de manera adicional a las cepas se les realizó tinción de Gram (para evaluar pureza) y análisis microscópico de para evaluar estabilidad morfológica después del proceso de conservación. 

Resultados y Discusión
De forma general se obtiene aproximadamente un 65% de supervivencia de las cepas bacterianas al emplear el método de conservación en agua destilada estéril, el cual es inferior al 100% de supervivencia reportado por Bueno y Gallardo, (1998) durante la conservación de diferentes géneros de hongos filamentosos, e igualmente inferiores a los valores considerados como permisibles para alcanzar una buena preservación de los microorganismos, los cuales oscilan entre 70-80% según García y Uruburu, (2000). Sin embargo al hacer el análisis individual del comportamiento de cada género bacteriano (tablas 3, 4, 5 y 6) y las condiciones de conservación, las conclusiones a las que podemos arribar son más alentadoras.

Tabla 3. Viabilidad a los 12 meses de las cepas de Azospirillum spp. en agua destilada estéril en condiciones de refrigeración (4oC) y a temperatura ambiente.

En los tubos positivos se observa el crecimiento típico del Azospirillum, halo blanquecino por debajo de la superficie del medio y cambio de coloración del mismo de verde a azul, debido a la producción de álcali (Pérez, 2002).

Tabla 4. Viabilidad a los 12 meses de las cepas de Azotobacter sp. en agua destilada estéril en condiciones de refrigeración (4oC) y a temperatura ambiente.


Tabla 5. Viabilidad a los 12 meses de las cepas de Xanthomonas albilineans en agua destilada estéril en condiciones de refrigeración (4oC) y a temperatura ambiente.


Tabla 6. Viabilidad a los 12 meses de las cepas de Bradyrhizobium japonicum en agua destilada estéril en condiciones de refrigeración (4oC) y a temperatura ambiente.


El crecimiento positivo de las cepas de Azotobacter, Xanthomonas, Bradyrhizobium y Xynorhizobium se observa en forma de turbidez. Como se puede observar en las tablas anteriores, los porcentajes de supervivencia de las cepas en condiciones de refrigeración son más bajos que los alcanzados cuando estas son mantenidas a temperatura ambiente, siendo particularmente bajos para los géneros Azospirillum (tabla 3) y Azotobacter (tabla 4), cuyos valores son inferiores a los rangos considerados como satisfactorios, sin embargo Estrada et al., (1999) alcanzaron un 100% de viabilidad, al conservar estas cepas en suelo estéril durante 2 años en condiciones de refrigeración. Los géneros Xanthomonas (tabla 5) y Bradyrhizobium – Xynorhizobium (tabla 6) alcanzan valores de 70.0 %, lo cual se considera como bueno. En todos los casos los mejores resultados se obtienen cuando las cepas son mantenidas a temperatura ambiente, con valores para Azospirillum de 75% (tabla 3) y llegan a alcanzar 90% en los géneros Xanthomonas (tabla 5) y Bradyrhizobium – Xynorhizobium (tabla 6). El porcentaje obtenido por las cepas del género Azotobacter (tabla 4), aunque no resulta totalmente satisfactorio, indican que la mitad de las muestras sobrevivió el proceso. Como promedio se obtuvieron valores de 76.0 % y 54.7 % de supervivencia de las cepas a temperatura ambiente y en condiciones de refrigeración respectivamente.

Los porcentajes de supervivencia alcanzados por cada una de las cepas independientemente del género bacteriano (tablas 3, 4, 5 y 6) confirman el planteamiento de García y Uruburu, (2000) en cuanto a que grupos taxonómicos y hasta líneas dentro de una misma especie, varían en su respuesta a los diferentes métodos de preservación, ya que las cepas USA 5b y Br17 de la especie A. lipoferum y Sp7, 8 INICA y KG3 de A. brasilense (tabla 3), a pesar de pertenecer a la misma especie, poseen comportamientos diferentes ante la conservación, con valores que van desde el 25 hasta el 100% de viabilidad. Similar comportamiento se observa para los géneros Xanthomonas (tabla 5) y Bradyrhizobium – Xynorhizobium (tabla 6), 

Los resultados obtenidos con Gluconacetobacter diazotrophicus tanto en condiciones de refrigeración como a temperatura ambiente fueron negativos, el método no resultó efectivo para este género, lo cual resulta lamentable, ya que la elevada cantidad de ácido acético producido por las bacterias de este género (Perin et al., 2004), dificulta su mantenimiento por transferencia periódica, limitando el período entre una y otra transferencia , lo cual va en detrimento del mantenimiento de las características genéticas de las cepas.

Aunque en microbiología frecuentemente se recomienda el mantenimiento de los cultivos en refrigeración, la supervivencia de nuestras cepas se vio afectada en estas condiciones. No debemos olvidar que este método se recomienda fundamentalmente para la conservación de hongos filamentosos, levaduras (Bueno y Gallardo, 1998; García y Uruburu, 2000; Mateos, 2002) y solo algunas bacterias (García y Uruburu, 2000).

La observación microscópica y la tinción de Gram, nos permitieron confirmar que después de la conservación se mantuvo la uniformidad celular en todas las cepas, los géneros Azospirillum, Azotobacter se tiñeron de color rosado como Gram negativos, mientras que los géneros se tiñeron de color azul como los Gram positivos. Las características de las cepas coinciden con las descripciones del Manual de Clasificación de Bacterias Bergeys (Bergeys, 2001), lo cual indica que los cultivos permanecieron puros y sin alteración morfológica.

A pesar de que para todos los géneros bacterianos estudiados los resultados obtenidos no fueron completamente satisfactorios, debido a su facilidad y bajo costo, recomendamos su empleo para la conservación de bacterias de los géneros Azospirillum, Xanthomonas, Bradyrhizobium y Xynorhizobium, en combinación con otros métodos alternativos o restringidos de probada utilidad como es la conservación en suelo estéril.

Conclusiones
1. Los porcentajes promedios de supervivencia alcanzados por las cepas de los géneros bacterianos estudiados, fueron mayores cuando estos se mantuvieron a temperatura ambiente (76.0 %), que en refrigeración (54.7 %), llegando a alcanzar el 90% en los géneros Xanthomonas, Bradyrhizobium y Xynorhizobium. 
2. Los géneros bacterianos con mayor supervivencia fueron Xanthomonas, Bradyrhizobium y Xynorhizobium con un 80 % de viabilidad.
3. Con el empleo del método de conservación en agua destilada estéril, las cepas bacterianas se mantienen puras y sin alteración morfológica. 

Recomendación
Emplear este método para la conservación de cepas de los géneros Azospirillum, Xanthomonas, Bradyrhizobium y Xynorhizobium y repetir el estudio empleando un mayor número de cepas y por un mayor período de tiempo.

Bibliografía utilizada
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Instituto Nacional de Investigaciones de la caña de azúcar (INICA). *juanita@inica.edu.cu. 

AUTORES:
Juana Pérez*, 
Mario Casas y 
Cecilia Beltrán.



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