Resumen: El Abey (Jacaranda coeruela L. Grises), es utilizado por la poblacion como planta medicinal para el tratamiento de granos, eczemas y hongos en uso topico como antibacteriano y antifungico, es por ello que esta investigacion partio del interes de poder caracterizar los metabolitos secundarios presentes en esta planta y evaluar su posible actividad antibacteriana...

Publicación enviada por Lic. Yuniel Capote Martínez; Lic. Harold Remón Rodríguez; Dra. Galina Morales Torres; MSc. Jorge Ramírez Arzuaga

RESUMEN
El Abey (Jacaranda coeruela L. Grises), es utilizado por la población como planta medicinal para el tratamiento de granos, eczemas y hongos en uso tópico como antibacteriano y antifúngico, es por ello que esta investigación partió del interés de poder caracterizar los metabolitos secundarios presentes en esta planta y evaluar su posible actividad antibacteriana. Para ello se le realizaron estudios fitoquímicos a todos los extractos obtenidos de la parte de la planta en estudio (hojas). Las pruebas in vitro realizadas a los extractos obtenidos en específico al de acetato de etilo, acuoso, seco y la tintura 20%, demostraron actividad antibacteriana frente a S. aureus. En estos extractos están presentes en mayor proporción: alcaloides, coumarinas, fenoles y/o taninos entre otros que pueden ser los responsables de esta actividad, se empleo como método de separación e identificación en cada extracto, la Cromatografía de Capa Fina y el tamizaje fitoquímico.

INTRODUCCIÓN
El uso de remedios de origen vegetal se remonta a la época prehistórica, y es una de las formas más extendidas de medicina presentes en todas las culturas conocidas. La industria farmacéutica actual se ha basado en los conocimientos tradicionales para la síntesis y elaboración de fármacos, y el proceso de verificación científica de estas tradiciones continúa hoy en día, con el descubrimiento constante de nuevas aplicaciones. Muchos de los fármacos empleados hoy en día como el opio, la quinina, la aspirina se replican sintéticamente o aíslan los principios activos de remedios vegetales tradicionales. Su origen persiste en las etimologías como el ácido salicílico, así llamado por extraerse de la corteza del Sauce. La medicina verde o fitoterapia, es tan antigua como la humanidad, el conocimiento que se tiene sobre ella se ha trasmitido de generación en generación y forma parte del acervo cultural de cada pueblo.1

Las plantas han sido utilizadas para tratar todo tipo de enfermedades. La aparición de las drogas sintéticas determinó su declinación a mediados del pasado siglo, sin embargo, en los últimos tiempos hay una motivación hacia los valores y la poca nocividad de las plantas medicinales a nivel mundial, en años recientes se han descubierto aplicaciones insospechadas para muchas plantas y sustancias derivadas de estas.2

Atendiendo a todo lo anteriormente planteado este trabajo se ha trazado como sigue:

OBJETIVO
Comprobar la acción antibacteriana in vitro de los extractos de las hojas de la Jacaranda coeruela L. Griseb, (Abey macho)

MATERIALES Y MÉTODOS
Se seleccionó la planta Abey atendiendo a los reportes dados por nuestra población que presenta acción antibacteriana, sin efectos terapéuticos comprobados experimentalmente. Se consideró además la disponibilidad de las mismas.

El material vegetal se recolectó al azar en el mes de diciembre a las 8:45 a.m., en el período óptimo y estuvo constituido por las hojas, planta que se encuentra en la localidad del Cucan, Jiguaní, Granma y fue identificada por el Departamento de Botánica de la Facultad de Ciencia Agrícolas de la Universidad de Granma.

El material fue lavado y desinfectado con una solución de hipoclorito de sodio al 2%, secado a la sombra a temperatura ambiente extendiéndose en bandejas perforadas, volteándose diariamente durante 7 días, luego se sometió a temperatura de 60°C durante 1h en estufa (MWN, Alemania) con circulación de aire. Seguidamente se procedió a la pulverización, usando un molino de cuchilla. Se obtuvo un polvo grueso que fue utilizado en la elaboración de los diferentes extractos.

Extractos etéreo, etanólico y acuoso
Para la obtención de los extractos, se pesaron 5g de muestra en balanza técnica (BS 2202S SARTORIUS, Alemania) y se le realizaron extracciones sucesivas con solventes de polaridad creciente (éter de petróleo, alcohol y agua) con la finalidad de lograr un mayor agotamiento de la droga en el material vegetal seco para ello se utilizó un volumen de solvente 10 veces mayor que su peso (5g).

Tintura al 20%
La tintura fue obtenida una vez recolectado el material vegetal, secado apropiadamente y tamizado a 0.5 mm de diámetro, utilizando como menstruo alcohol al 70%. Se utilizaron 40g de la droga cruda para obtener 200mL de tintura al 20%. La extracción de la tintura se realizó por maceración de la droga pulverizada, por 7 días3, empleando agitador mecánico o saranda (ILM tipo THYS 2, Alemania).

Después de realizada la extracción y lograda la homogeneidad y transparencia total, la tintura, se colocó en frasco ámbar para evitar la descomposición de las sustancias activas por acción de la luz, ya que muchas sustancias activas extraídas de plantas son fotosensibles. Se dejaron reposar por 3 días en refrigeración a 8°C y luego se sometieron a los análisis de calidad.

Extractos secos
El extracto seco de Abey fue obtenido a partir de la tintura al 20% por rotoevaporación del solvente a 50°C con un rotoevaporador (KIKA-Werke, Alemania) hasta obtener una masa consistente, la cual fue secada en una estufa, con circulación de aire a 40°C, finalmente el extracto fue triturado en un mortero y preservado en frasco ámbar.

Especificaciones de calidad
La determinación de los parámetros de calidad se llevó a cabo mediante la aplicación de los métodos de ensayos para verificar los requisitos de los extractos fluidos y tinturas entre los cuales están: pH, índice de refracción, densidad relativa y sólidos totales.4, 5

Tamizaje fitoquímico
El tamizaje fitoquímico se realizó en el Laboratorio de Productos Naturales de la Universidad de Granma. Bayamo. Cuba, por la metodología reportada, 6, 7, 8 realizándose tres réplicas para cada ensayo. Se emplearon pruebas o técnicas simples, rápidas y selectivas para la determinación de los diferentes metabolitos secundarios.

Extracciones sucesivas
Las extracciones sucesivas se realizaron a partir de la droga seca se prepararon 5g de la droga en 50 mL de solvente (n-hexano, cloroformo, acetato de etilo y agua) con polaridad creciente. Cada extracto se macero por un período de 24h. Luego cada una de estas fracciones se secaron y se les realizaron ensayos microbiológicos y el tamizaje fitoquímico.9, 10

Cromatografía de Capa Fina (CCF)
Para la Cromatografía en Capa Fina (CCF) se emplearon placas cromatográficas de sílica gel (20x20cm., 2mm de espesor, Aldrich- Sigma). El seguimiento de la separación de los compuestos se llevó a cabo a través de la observación de los perfiles cromatográficos bajo la luz ultravioleta (=365nm) con una lámpara (WD 9403E, China).10

Sistema de solventes utilizados
A₁ (7:1) Tolueno : Acetato de etilo.
A₂ (4: 1) Acetato de etilo : Acido acético.
A₃ (1:1) Acetato de etilo : Metanol.

Evaluación de la actividad antibacteriana
Para la evaluación de la actividad antibacteriana se empleó el método de difusión en agar por diseminación superficial en disco (Bauer-Kirby). Este método fue publicado por la U.S. Food and Drug Administration (FDA) y la Organización Mundial de la Salud (WHO, del inglés, World Health Organization) y adoptada por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, antes NCCLS) como norma de aceptación general 11.

Evaluación de los resultados
La zona de inhibición es el área que rodea al disco donde el crecimiento ha sido completamente inhibido. Los resultados se expresaron como el diámetro del halo de inhibición del crecimiento, medido en mm, con una regla milimetrada.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tamizaje fitoquímico de la tintura al 20% y extracto seco de las hojas de Abey.
En la tabla I se muestran los resultados del tamizaje fitoquímico realizado a la tintura al 20% y al extracto seco de la parte en estudio de la planta (hojas). Estos productos fueron sometidos a los mismos análisis fitoquímicos con fin de evaluar la influencia de las condiciones aplicadas en la composición química, por ser el extracto seco más práctico como formulación farmacéutica para la aplicación tópica, en el caso de enfermedades provocadas por bacterias. Se puede notar claramente que son abundantes los metabolitos secundarios, destacándose un alto contenido de alcaloides y coumarinas.

Tabla I. Resultados del tamizaje fitoquímico de la tintura al 20% y el extracto seco de las hojas de Abey.


Es válido destacar que la composición química de la tintura 20% y el extracto seco se muestra semejante. Este resultado nos demuestra que los metabolitos secundarios presentes en esta planta no se descomponen fácilmente al se sometidos a temperaturas moderadas ya que prácticamente se mantienen los mismos resultados en ambos extractos con diferencia solamente en el ensayo de Wagner para la determinación de alcaloides, que disminuye su concentración en el extracto seco, hecho que se puede justificar por fenómenos de descomposición química de los metabolitos secundarios por la acción del calor y a los efectos de la actividad oxidante del oxígeno del aire por exposición directa de los fitocompuestos, debido a la ausencia del solvente. Por lo tanto la acción farmacológica debe mantenerse inalterable para ambas formulaciones, ya que es conocida la dependencia entre composición química y propiedades biológicas.

Debido a la presencia de ciertos metabolitos secundarios y a la concentración de los mismos en las hojas de la planta en estudio estas pueden presentar diferentes propiedades medicinales atribuyéndosele estas a la presencia de quinonas, coumarinas, triterpenos y esteroides, alcaloides, fenoles y taninos y flavonoides por lo que se supone que esta parte de la planta podrían ser utilizada como antibacteriana y antifúgica, además de otras aplicaciones como astringentes, antisépticas y antihelmínticas.12, 13

Control de calidad de la tintura al 20% de las hojas de Abey.
En la tabla II se muestran los resultados de la determinación de los parámetros de calidad de las tinturas al 20% de las hojas de Abey, los cuales están en los rangos de calidad que establecen las normas para el uso de las formulaciones, 4, 5 tienen un valor de los sólidos totales superior a 2.3 lo que indica una concentración adecuada de principios activos. La densidad está por encima de 0.80 g/mL y el pH es ácido, hecho éste que unido al medio etanólico admite su estabilización y conservación por un período de tiempo largo, lo que permite certificar un determinado nivel de seguridad para la utilización óptima de esta tintura con fines terapéuticos.

Tabla II. Control de calidad de la tintura al 20% de las hojas del Abey.



Ensayo preliminar in vitro de la tintura 20 % y el extracto seco de las hojas de Abey.
Con la finalidad de determinar la actividad antibacteriana de las formulaciones preparadas, se procedió a la realización de un ensayo preliminar in vitro haciendo uso del método de difusión en agar por diseminación superficial en disco de Bauer-Kirby. Los resultados obtenidos de la tintura al 20% y en el extracto seco evaluados frente a 6 cepas bacterianas, se encuentran reflejados en la tabla III.

Tabla III. Resultados de la evaluación preliminar in vitro del extracto seco y la tintura 20% de las hojas de Abey.



La tintura 20% y el extracto se evaluaron frente a cepas de P. auriginas, Echericha coli, Salmonella enterica, Shigella sp, Proteus mirabilis y S. aureus (tabla III). Presentando actividad antibacteriana, mostrada por la inhibición del crecimiento de 7- 8 mm frente al S. aureus.

Por lo anteriormente explicado es válido destacar que los resultados obtenidos sugieren que las hojas de Abey presentan principios activos con capacidad antibacteriana, por lo que se hace necesario continuar con los estudios hacia etapas avanzadas.

Atendiendo a lo anteriormente explicado se realizaron extracciones a partir de 5 g de la droga seca con solventes de polaridad creciente: n-hexano, cloroformo, acetato de etilo y agua con un volumen de solvente de 10 veces el peso de la droga seca utilizada, para lograr una separación de las familias de principios activos atendiendo a su solubilidad en los diferentes solventes con polaridades desiguales. Estás extracciones fueron evaluadas frente a las cepas de bacterias antes mencionadas, como se muestra a continuación.

Evaluación de la actividad antibacteriana de los extraciones obtenidas de las hojas del Abey macho.
En la tabla IV se muestra un resumen de los datos obtenidos de la evaluación in vitro de la actividad antibacteriana de los extractos de la planta frente a seis cepas de microorganismos una Gram (+) (S. aureus) y cinco Gram (-) (Proteus mirabilis, P. auriginasa, Shigella sp, Salmonella enterica y Echericha coli).

Es necesario destacar que a pesar que la tintura 20% y el extracto seco (tabla III) solamente mostraron inhibición frente a S. aureus, se consideró necesario no excluir el resto de las bacterias Gram (-) evaluadas, por el hecho de que por el fraccionamiento realizado a la muestra se pueda haber separado el (los) principio(s) activos que presenten actividad antibacteriana y que anteriormente no hayan mostrado actividad por el antagonismo que pueda presentarse en este tipo de muestras tan complejas.

En este ensayo se emplearon discos de un antibiótico comercial como control positivo y discos de papel de filtro (7 mm de diámetro) conteniendo el solvente, empleado en la preparación de las soluciones de los extractos de hojas de Abey, como control negativo (DMSO). Se evaluaron tres concentraciones de los extractos de hojas de Abey, (180, 360, 720 µg/disco),

En la tabla IV se evidencia que el control positivo presenta halos de inhibición entre 17-21 mm de diámetro (Anexo 2), que según la tabla de clasificación de la susceptibilidad de los microorganismos (Anexo 3), publicada por el CLSI, las cepas de Escherichia coli (ATCC 113-3), Proteus mirabilis (ATCC), Pseudomonas aeruginosa (ATCC), Salmonella enterica (ATCC) y Staphylococcus aureus (ATCC) son susceptibles (S) mientras que la cepa de Shigella sp., tiene sensibilidad intermedia (I) a ellos.14

Tabla IV. Resultados de la evaluación antibacteriana in vitro de los extractos de las hojas del Abey macho.




Los resultados de la tabla evidencian que el extracto seco, de acetato de etilo y el acuoso de las hojas de Abey tienen actividad antibacteriana frente a la cepa de Staphylococcus aureus (ATCC) a las concentraciones de 360 y 720 µg/disco y de 180 µg/disco solo en el caso del extracto de acetato de etilo, con halos de inhibición entre 7 y 9 mm de diámetro. Estos resultados, conjuntamente con la ausencia de halo de inhibición alrededor del disco conteniendo DMSO (control negativo), nos sugieren que las hojas de Abey presentan metabolitos secundarios, con actividad antibacteriana. Presentando los mismos una polaridad alta pues solamente los extractos de acetato de etilo y acuoso mostraron actividad y no así los extractos hexánico y clorofórmico (tabla V).

Es de destacar además que solamente mostró actividad a la baja concentración de 180 µg/disco, el extracto de acetato de etilo, indicando que en este extracto se encuentra la mayor concentración de principios activos con actividad antibacteriana y el hecho de que el extracto seco no presente actividad a esta concentración (tabla IV) se justifica por el posible antagonismo de los metabolitos secundarios presentes en este extracto y evidencia la importancia de conocer los principios activos responsables de la actividad antibacteriana de los extractos secos de las hojas de Abey, por lo que se debe trabajar en el aislamiento y purificación de ellos para probar su verdadero potencial antibacteriano. Los resultados de la actividad contra el Staphylococcus aureus (ATCC) de los extractos secos de hojas de Abey son similares a los obtenidos por Bhandari et al (2000)15 frente a Staphylococcus aureus quienes emplearon discos con 1 mg/disco de extracto seco de Berberis asiática.

A partir de estos resultados (tabla V) se pudo constatar que no existen diferencias entre ninguna de las concentraciones de los extractos de Abey evaluados para la cepa de S. aureus. Estos resultados sugieren que a mayores concentraciones de extracto seco de hojas de Abey no se obtendrán mejores resultados frente a Staphylococcus aureus (ATCC), que pudieran explicarse teniendo en cuenta que los sistemas biológicos presentan una concentración de saturación de la actividad, basado en que el mecanismos de acción del principio activo pudiera estar mediado por reconocimiento molecular y no por acción inespecífica.

Aunque la clasificación de las cepas de S. aureus frente a los extractos evaluados es resistente (R) a diferencia de los antibióticos comerciales ante los cuales estas cepas tienen susceptibilidad. Hay que tener en cuenta la diferencia de las concentraciones de los principios activos entre los discos de antibióticos comerciales y los que contienen los extractos vegetales de las hojas del Abey; esto se debe a que los discos comerciales de antibióticos contienen el principio activo con altos niveles de pureza, en tanto los discos con papel de filtro que contienen los extractos vegetales, las concentraciones utilizadas, están influenciadas por la gran variabilidad de metabolitos secundarios presentes en ellos, a la baja concentración de los constituyentes químicos presentes en el extracto vegetal con actividad antimicrobiana y a la acción antagónica que ejercen sobre ellos otro grupo de compuestos.

Entre los principios activos que pueden presentar actividad antibacteriana se encuentran las saponinas, alcaloides, flavonoides, quinonas, coumarinas, fenoles, taninos, triterpenos y esteroides entre otros, 16 previamente determinados mediante tamizaje fitoquímico.

Resultados semejantes a nuestra investigación, fueron los reportados por investigadores en Guatemala, donde estudiaron 5 especies de plantas, que popularmente se utilizan en el tratamiento de enfermedades dérmicas, contra patógenos humanos, entre ellos: E. coli, P. aeruginosa, S. aureus y Shiguella 14 y la de Duraipandiyan, en un amplio estudio, efectuado en la India a 18 especies de plantas medicinales, frente a 9 cepas bacterianas, empleando como mínima concentración (2.5 mg/disco) lo que representa una concentración mayor que la concentración utilizada en el presente estudio, donde se observó la actividad frente al Staphylococcus aureus (ATCC),17 resultando mejores los resultados alcanzados en la presente investigación, pues utilizando concentraciones menores, los principios activos de la planta en estudio, son más potentes.

La inhibición de crecimiento del Sthaphylococcus aureus (ATCC) frente a los extractos utilizados constituye un nuevo aporte de actividad antibacteriana de la planta estudiada, no obstante no se puede afirmar que los principios activos tienen un mecanismo de acción específico frente a las bacterias Gram (+) pues esta cepa es la única utilizada para el ensayo, por lo que se hace necesario realizar evaluaciones de actividad antibacteriana frente a otras cepas bacterianas Gram (+) para poder llegar a una conclusión mejor fundamentada.

Tamizaje fitoquímico y CCF de los extractos con actividad antibacteriana obtenidos a partir de las hojas del Abey.
A los extractos que mostraron actividad antibacteriana (tabla IV) se les realizó el tamizaje fitoquímico18 con el objetivo de identificar aquellos metabolitos secundarios responsables de esta propiedad del Abey macho. Para corroborar la presencia de los mismos se empleó la Cromatografía de Capa Fina, sin revelador químico a  = 365 nm.

Tabla V. Tamizaje fitoquímico del extracto de acetato de etilo de las hojas de Abey.



La tabla V muestra la presencia de metabolitos secundarios en el extracto acetato de etilo de las hojas de Abey macho, con propiedades antibacterianas, entre los que se destacan los alcaloides, fenoles, taninos, triterpenos y esteroides. Es preciso destacar la abundancia detectada de alcaloides (Mayer), justificando esto la actividad antibacteriana reportada por este extracto a 180 µg/disco (véase tabla IV).

Tabla VI. CCF. Extracto de acetato de etilo de las hojas del Abey con sistema de solvente A1.



Figura 1. CCF. Extracto de acetato de etilo con sistema de solvente A1 .


Como se observa en la tabla VI y la figura 1 la Cromatografía de Capa Fina para el Abey en el extracto acetato de etilo para el sistema de solvente (A1) arrojó la presencia de 1 mancha de color rojo intenso que pueden ser alcaloides, fenoles, taninos triterpenos y esteroides.9, 19 También se observó que en el punto de aplicación quedó una mancha de color marrón oscuro indicando, que la selección de solventes no fue la idónea para la separación de la muestra, entonces se decidió cambiar el sistema de solvente por uno de polaridad mayor (sistema A2). Mostrándose los resultados de la CCF en la tabla VII y figura 2.

Tabla VII. CCF. Extracto de acetato de etilo de las hojas del Abey con sistema de solvente A2.



Figura 2. CCF. Extracto de acetato de etilo con sistema de solvente A2.


En la figura 2, se puede visualizar 3 manchas con diferencias notables en la variedad de colores. Estos resultados son alentadores y pueden ayudar a la confirmación de los obtenidos en el tamizaje fitoquímico, pues estas coloraciones han sido descritas en trabajos anteriores para estos compuestos tales como: alcaloides (verdes, azul), coumarinas (rosada), triterpenos, esteroides, fenoles y taninos (azul).10, 20

Como se puede observar en los resultados del tamizaje fitoquímico realizado al extracto acuoso (tabla VIII), el (los) principio(s) activo(s) que pueden ser los responsable(s) de la actividad biológica detectada, puede ser uno o varios de los representantes de los alcaloides, taninos, coumarinas, fenoles, flavonoides, triterpenos y esteroides en general, pues estos fueron los metabolitos para los que se registraron resultados positivos en los ensayos desarrollados.

Tabla VIII. Tamizaje fitoquímico del extracto acuoso de las hojas del Abey.



Al proceder a la identificación de los metabolitos presentes en el extracto acuoso a través de CCF, sin revelador químico a UV 365 nm, se pudo observar una gran variedad de manchas (figura 3) que se encuentran entre los colores azul claro y amarillo a diferentes Rf (tabla IX) dentro de los que se encuentran alcaloides coumarinas, flavonoides (amarilla), fenoles, taninos, triterpenos y esteroides (azul), indicando que la muestra presenta una gran cantidad de metabolitos secundarios corroborando de esta forma el tamizaje fotoquímico realizado a este extracto.

Tabla IX. CCF. Extracto acuoso de las hojas del Abey con sistema de solvente A3.



Figura 3. CCF. Extracto acuoso con sistema de solvente A3.


El tamizaje fitoquímico de los extractos y el empleo de la Cromatografía de Capa Fina dan fe de que en la planta objeto de estudio (Abey macho) los metabolitos secundarios más abundantes son: los alcaloides, fenoles, taninos, triterpenos, esteroides y coumarinas. Destacando la alta concentración detectada en ambos extractos (de acetato de etilo y acuoso) de alcaloides por ambos métodos. Por lo que se puede concluir que este metabolito secundario identificado podría ser el principal responsable de la actividad antibacteriana determinada.

Los resultados obtenidos de los ensayos antibacterianos de los extractos de acetato de etilo y acuoso del Abey se deben probablemente a la presencia de principios activos con propiedades farmacológicas semejantes, o a un sinergismo de los constituyentes.

Los resultados coinciden con los reportados en otras investigaciones en donde se ha comprobado la acción antibacteriana de estos metabolitos. 19, 21 No obstante, no fue posible establecer una clara relación entre el halo de inhibición y un tipo de constituyente en particular.
Todos estos resultados constituyen hasta la fecha el primer reporte fitoquímico de estas especies y de la actividad antibacteriana in vitro.

Conclusiones
1. Los metabolitos secundarios presentes en los extractos de las hojas de Jacaranda coerulea L. Griseb son: flavonoides, triterpenos, esteroides, alcaloides, ácidos grasos, saponinas, carbohidratos reductores, aminoácidos libres, fenoles, taninos y coumarinas.
2. La tintura al 20% y los extractos de acetato de etilo, acuoso y seco del Abey macho presentan actividad antibacteriana frente a S. aureus (ATCC).
3. Se identificó la presencia de: triterpenos, esteroides, fenoles, taninos, coumarinas y alcaloides, estos últimos en mayor abundancia; mediante CCF y el tamizaje fitoquímico de los extractos de acetato de etilo y acuoso de las hojas del Abey, pudiendo ser los responsables de la actividad antibacteriana.
Recomendaciones
1. Aislar, purificar y caracterizar los principios activos responsables de la actividad antibacteriana.
2. Ampliar estudios en vistas a identificar otras actividades biológicas de la planta (Abey) como la antifúngica.

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