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Cuantificacion de enzimas en fraccion microsomal hepatica de rata

Resumen: La cuantificacion de enzimas hepaticas constituye en nuestros dias una via o herramienta mas para determinar el dano hepatico existente de una droga y recientemente descrito en esta decada para determinar la existencia de drogas antioxidantes que previenen el estres oxidativo...

Publicación enviada por Daniel Francisco Arencibia Arrebola




 


Resumen
La cuantificación de enzimas hepáticas constituye en nuestros días una vía o herramienta más para determinar el daño hepático existente de una droga y recientemente descrito en esta década para determinar la existencia de drogas antioxidantes que previenen el estrés oxidativo. Existen diferentes protocolos de cuantificación para ello establecidos, los cuales usted debe estandarizar según sus condiciones reales de equipamiento, reactivos, personal calificado, entre otros. El objetivo de este trabajo es definir el protocolo de 4 técnicas enzimáticas, estandarizadas bajo nuestras condiciones experimentales, las cuales ayudarían a proveer a los toxicólogos de un material de partida para la realización de estas técnicas en sus laboratorios. Tuvimos en cuenta la metodología para la determinación del citocromo P-450 y el citocromo b5, actividad enzimática de la NADPH citocromo C reductasa y la determinación de la actividad de la aminopirina desmetilasa, todas en fracción microsomal hepática.

Palabras claves: Metodología, citocromo P-450, citocromo b5, NADPH citocromo C reductasa, aminopirina desmetilasa.

Introducción
La cuantificación de enzimas hepáticas constituye en nuestros días una vía o herramienta más para determinar el daño hepático existente de una droga y recientemente descrito en esta década para determinar la existencia de drogas antioxidantes que previenen el estrés oxidativo. Existen diferentes protocolos de cuantificación para ello establecidos, los cuales usted debe estandarizar según sus condiciones reales de equipamiento, reactivos, personal calificado, entre otros.1

Las enzimas que intervienen en el metabolismo oxidativo de xenobióticos (fase I) se denominan oxidasas de función mixta (citocromo P 450 -CYP- y flavin monooxigenasa) y se encuentran en el retículo endoplásmico liso de las células. No existen dudas que la biotransformación de xenobióticos se lleva a cabo principalmente en el hígado, aunque se ha reportado actividad metabólica en diferentes tejidos extrahepáticos como la mucosa intestinal.2

Además de su rol principal en la absorción de nutrientes y agua, la mucosa intestinal es la vía principal de entrada de xenobióticos al organismo y posee las enzimas necesarias para la transformación de los mismos por medio de diferentes reacciones metabólicas de fase I y II. Diferentes actividades N-desmetilasa CYP-dependientes han sido identificadas en microsomas intestinales de ovinos y bovinos.3, 4

El objetivo de este trabajo es definir el protocolo de 4 técnicas enzimáticas, estandarizadas bajo nuestras condiciones experimentales, las cuales ayudarían a proveer a los toxicólogos de un material de partida para la realización de estas técnicas en sus laboratorios. Tuvimos en cuenta la metodología para la determinación del citocromo P-450 y el citocromo b5, actividad enzimática de la NADPH citocromo C reductasa y la determinación de la actividad de la aminopirina desmetilasa, todas en fracción microsomal hepática.

Desarrollo
1. Metodología para la determinación del citocromo P-450 y el citocromo b5.

Describiremos el procedimiento para la cuantificación del contenido de los citocromos P-450 y citocromo b5 presentes en la fracción microsomal hepática.5
a. Obtención de CO.
Sustancias: 200 mL de ácido fórmico (HCOOH), 300 mL de ácido sulfúrico (H2SO4).
Material necesario: matraz redondo (1000 mL), embudo de llave, frasco lavador, gasómetro.

El matraz redondo se provee con un tapón de 2 orificios, por los que pasen un embudo de llave y un tubo de desprendimiento conectado con el frasco lavador.

Como gasómetro puede servir un frasco de vidrio grande, lleno de agua y cerrado con un tapón de caucho que lleve dos tubos: el del gas de entrada (que termina debajo del tapón) y otro que llega hasta el fondo, por el cual va saliendo el agua a medida que es desalojada por el gas que entra.6

En el matraz se coloca el ácido sulfúrico concentrado que se calienta previamente a 100-120 oC y desde el embudo de llave se va dejando caer gota a gota el ácido fórmico.

El gas desprendido pasa por un frasco lavador que contiene sosa cáustica al 20% para retener el CO contaminante y se recoge finalmente en el gasómetro.7

A medida que se va añadiendo el ácido fórmico, disminuye el desprendimiento de gas, porque se diluye el ácido. Es necesario para completarlo, calentar con una llama pequeña.
HCOOH-------CO + H2O, donde el agua es retenida por el ácido sulfúrico.8

b. Procedimiento experimental:
1-Diluir la suspensión microsomal hepática hasta alcanzar 3 mg/mL de proteína utilizando buffer A.
2-Adicionar a la suspensión 3-4 mg de ditionito de sodio y mezclar.
3-Pasar la suspensión a dos cubetas de medición de D.O.
4-Burbujear en una cubeta CO según se describe anteriormente durante 15 seg, tapar la cubeta y agitar.
5-Leer el espectro de absorción de cada cubeta entre 400-500 nm. Utilizar la cubeta no gaseada como referencia.

Cálculo de los resultados:
La cantidad de citocromo P-450 es calculada de la diferencia de la D.O. a 480 nm y la D.O. a 450 nm.9
Contenido de P-450 = D.O. x 1000 en nmoles/mg prot.
91 x mg prot/ml
91=coeficiente de extinción molar en mM/cm.

2. Determinación de la actividad enzimática de la NADPH citocromo C reductasa en fracción microsomal hepática.
Mediante este procedimiento se determina la actividad de esta enzima en fracción microsomal hepática.10
a. Reactivos utilizados.
-Tris-HC1, 200 mM, pH=7,4.
-Citocromo C 50 µM.
-Fosfato de Potasio (KH2PO4) 10 mM.
-KCN 330 µM.
-NADH 100 µm ó NADPH 10 mM.

b. Soluciones a preparar:
-Tris-HC1 200 mM pH=7.4 (P.M.=121,14)

Se prepara una solución de 200 mM para lo cual se deben tomar 10 mL de una solución Tris-HCI 1 M pH=7,4 y se completan a 50 mL en un volumétrico con H2O destilada.
-Citocromo C 50 µM (P.M.=12,27).
Se pesan 92 mg de la proteína y se completa a 5 mL. Con la solución de KH2PO4 a 10 mM
-Fosfato de Potasio (KH2PO4)10 mM.
Pesar 1,36 g disolver en H2O destilada hasta aproximadamente 900 mL para poder ajustar pH=7,7. Ajustado el pH enrasar a 1 000 mL.
Esta solución es utilizada para preparar el Citocromo C.
-KCN 330 µM (P.M.=65).

Se prepara una solución madre 9,9 mM para lo cual se pesan 6,435 mg y se completan a 10 mL con agua destilada; (tener mucho cuidado con la manipulación de este reactivo debido a que es un veneno).11
-NADH 100 µM (P.M=664.44).

Se prepara una solución madre 3 mM para lo cual se disuelven 20 mg de NADH a 10 mL de volumen final con H2O destilada.

c. Procedimiento Experimental:
1. Prepare una mezcla de incubación en una cubeta de 3 mL, mezcle:
- 1.5 mL de Tris-HCI.
- 100 µL de Citocromo C.
- 100 µL de KCN.
- 1.2 mL de H2O destilada.
- 10 µL de muestra.

2. Prepare una mezcla de referencia en una cubeta de 3 mL, adicione:
- 1,5 mL de Tris-HCl.
- 100 µL de Citocromo C.
- 1,3 ml de H2O destilada.
- 10 µL de la muestra.

3. Incube a 30°C durante 5 minutos.
4. En un espectrofotómetro, UV-visible ajuste a 0 a 550 nm.
5. Tire una línea base por 3 minutos.
6. Adicione 100 µL de NADH a cada cubeta.
7. Lea a 550 nm/3 minutos.

d. Cálculos: 12
AE= DO 5503 x 3 x 106 x 1 x 1
K=18,5 103 t (min) mg proteína
AE = nm cit. C reducido/mg proteína/min

3. Metodología para la determinación de la actividad de la aminopirina desmetilasa en fracción microsomal hepática.
A continuación se presentará la metodología utilizada para la cuantificación de la actividad de la enzima aminopirina desmetilasa en la fracción microsomal hepática.13 Se determina la actividad de la aminopirina desmetilasa por la medida de la formación de formaldehído, el cual resulta un intermediario en las reacciones de desmetilación oxidativas que ocurren en el hígado.14

Preparación de soluciones. 15
1- Preparar una solución de aminopirina (50 mM) y MgCI (25 mM) en H2O destilada.
* Para preparar 100 mL de la solución pesar: 1,155 g de aminopirina + 508,2 mg de C12Mg x 6H2O.

2- Solución de cofactores: NADP (0,60 mM) y glucosa 6-fosfato (3,33 mM) en tampón fosfato Na+/K+ 0,5 M a pH 7,4.
* Para preparar 25 mL de la solución de cofactores pesar: 11,59 mg de NADP + 25,33 mg de glucosa 6-fosfato.
* Esta solución se prepara antes de usarse y se conserva hasta el momento de su utilización en frío.

3- Solución madre básica de fosfato bipotásico 0,5 M en H2O destilada.
* Para 1 000 mL pesar 87,1g de PO4HK2 x 3H2O.

4- Solución madre ácida de fosfato monosódico 0,5 M en H2O destilada.
* Para 1 000 mL pesar 78 g de PO4H2Na x 2H2O.

5- Solución tampón de fosfato Na+/K+ 0.5 M a pH 7.4.
* Mezclar 39,2 mL de la solución 4 + 160,8 mL de la solución 3 y llevar a 200 mL.

6- Solución de sulfato de zinc al 15 %.
* Para 100 mL de H2O pesar 26,7 g de SO4Zn2 x 7H2O.
* Conservar a temperatura ambiente.

7- Solución saturada de hidróxido de bario Ba(OH)2.
* Esta solución se prepara agregando el hidróxido en H2O en ebullición hasta que la solución esta bien saturada.
* Filtrar la solución hirviente y notar que se formen cristales.
* Conservar a temperatura ambiente.

8- Reactivo de Nash.
* Este reactivo se prepara en H2O destilada y debe prepararse antes de usarlo.
* Pesar 30 g de acetato de amonio, adicionar 0.4 mL acetil acetona y llevar a 100 mL.

9- Estándar de formaldehído.
* 0.2 mL de formaldehído (que tenga un grado de pureza alrededor del 40 %) y llevar a 100 mL con H2O destilada.
* Conservar en frío.

10- Buffer fosfato 0,1 M a pH 7,4.
* Preparar una solución madre ácida 0,1 M. Para 1 000 mL de H2O destilada pesar 15,65 g de PO4H2Na x 2H2O (solución A).
* Preparar una solución madre básica 0,1 M. Para 1 000 mL de H2O destilada pesar 17,4 g PO4HK2 x 3H2O (Solución B).
* Para 200 mL de buffer fosfato mezclar 39,2 mL de la solución A y 160,8 mL de la solución B.
* Ajustar el pH a 7,4.

11-Buffer de fosfato Na+/K+ 0,1 M a pH 7.4 + KCl 0,15 M
* Pesar 1,15g KCI y llevar a 100 mL con el buffer fosfato de Na+/K+ 0,1 M a pH 7,4.

Procedimiento experimental: 16
1- Preparar una mezcla de reacción que contenga:
• 0,5 mL de solución de aminopirina MgCl (sustrato).
• 10 ml de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa.
• 0,8 mL de buffer fosfato Na+/K+ 0.1 M a pH 7.4 conteniendo KCl (si se determina la actividad de una muestra inducida) ó 0,5 mL de este buffer si la muestra es de una fracción no inducida.

2- Incubar esta mezcla durante 5 minutos a 37 °C.

3- Iniciar la reacción adicionando 0,2 mL de muestra (fracción microsomal hepática obtenida a 9 000 g, si la muestra es inducida) ó 0,5 mL si es una muestra no inducida.

4- Detener la reacción a los 5 minutos adicionando l mL de Zn2SO4 y agitar vigorosamente.

5- Adicionar l mL de Ba(OH)2 y agitar.

6- Adicionar l mL de reactivo de Nash y agitar.

7- Incubar durante 10 min a 60 °C en baño de María.

8- Centrifugar durante 5 min a 2 500 rpm.

9- Extraer el sobrenadante con pipeta pasteur.

10- Leer la absorbancia a 412 nm contra el blanco de H2O destilada.

Blanco de Nash:
• 5 mL de H2O destilada.
• 1 mL de Nash.
• Calentar a 60 °C durante 10 min.

Blanco de muestras:
• 1 mL de Zn2SO4.
• 0,2 mL de muestra y agitar.
• 1 mL de Ba(OH)2.
• 0,8 mL de tampón fosfato empleado en la mezcla de reacción.
• 1 mL de Nash.

Blanco de H2O
5 mL del H2O utilizada en la determinación.

Estándar de formaldehído
- Tomar 0.2 mL de la solución patrón de formaldehído y llevarlo a 50 mL con H2O destilada.
- Tomar 5 mL de la solución anterior y adicionarle l mL de Nash.
- Calentar durante 10 minutos a 60 °C.
- Leer la absorbancia a 412 nm, esta solución es un estándar interno y debe dar una lectura de 0,68 a 412 nm.17

Referencias:
1. Ciolino HP, Daschner PJ, Wang TT, Yeh GC. Effect of curcumin on the aryl hydrocarbon receptor and cytochrome P450 1A1 in MCF-7 human breast carcinoma cells. Biochem. Pharmacol 1998; 56(2):197-206.
2. Ciolino HP, Daschner PJ, Yeh GC. Resveratrol inhibits transcription of CYP1A1 in vitro by preventing activation of the aryl hydrocarbon receptor. Cancer Res 1998; 58(24):5707-5712.
3. Donato MT, Serralta A, Jiménez N, Pérez G, Castell JV, Mir J, Gómez-Lechón MJ. Liver grafts preserved in Celsior solution as source of hepatocytes for drug metabolism studies: Comparison with surgical liver biopsies. Drug Met. Disp 2005; 33:1-7.
4. Mansouri A, Demeilliers C, Amsellem S, Pessayre D, Fromenty B. Acute ethanol asministration oxidatively damages and depletes mitocondrial DNA in mouse liver, brain, heart, and skeletal muscles: protective effects of antioxidants. J Pharmacol Exp Ther 2001; 298: 737-743.
5. Aruoma OI, Spencer JP, Rossi R, Aeschbach R, Khan A, Mahmood N, Munoz A, Murcia A, Butler J, Halliwell B. An evaluation of the oxidation and antiviral action of extracts of rosemary and Provencal herbs. Food. Chem. Tox 1996; 34:449-459.
6. Bapiro TE, Egnell AC, Hasler JA, Masimrembwa CM,. Application of higher throughput screening (HTS) inhibition assays to evaluate the interaction of antirapasitic drugs with cytochrome P450. Drug Metab. Dispos. 2001; 29:30-35.
7. Brosen K. Drug interactions and the cytochrome P450 system: the role of cytochrome P4501A2. Clin. Pharmacokinet 1995; 29:20-25.
8. Castell JV, Gómez-Lechón MJ, Ponsoda X, Bor, R. In vitro investigation of the molecular mechanisms of hepatotoxicity, in In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Castell., J.V., Gómez-Lechón, M.J. eds, Academic Press, London; 1997.p.375-410.
9. Donato MT, Gómez-Lechón MJ, Castell JV. A microassay for measuring cytochrome P4501A1 and P450IIB1 activities in intact human and rat hepatocytes cultured in 96-well plates. Anal. Biochem 1993; 213:29-33.
10. Alegret i Jordà, M. Efecto “in vivo” de los derivados fíbricos sobre enzimas microsomales implicados en la síntesis hepática de ácidos grasos. Farmacología. Terapéutica. Toxicología. Radiología. ISBN: B.34477-2009/978-84-692-4507-1.URL:http://www.tdx.cat/TDX-0706109-090048; 2009.p.89-95.
11. Roll FJ, Alexander MA, Cua D, Swanson W, Perez HD. Metabolism of ethanol by rat hepatocytes results in generation of lipid chemotactic factor: studies using a cell-free system and role of oxygen-derives free radicals. Arch Biochem Biophis 1991; 287: 218-224.
12. Zima T, Fialova L, Mestek O, Janebova M, Crkovska J, Malbohan I, Stipek S, Mikulikova L, Popov P. Oxidative stress, metabolism of ethanol and alcohol-related diseases. J Biomed Sci 2001; 8:59-70.
13. Gutiérrez JM. Tratado de Hepatología. vols 2. Universidad de Sevilla. (ed.) Servicio de Publicaciones. ISBN: 9788447203338. Plaza edición: Sevilla; 1996.p.245-258.
14. Tuma DJ. Role of malondialdehyde-acetaldehyde adducts in liver injury. Free Radic Biol Med 2002; 32: 303-308.
15. Reinke LA. Spin trapping evidence for alcohol-associated oxidative stress. Free Radic Biol Med 2002; 32:953-957.
16. Ortiz J. J, Jonquera F, Culebras J, Villares C, González J, Tuñón M.J. Influencia de la formulación de la glutamina en sus efectos sobre los sistemas antioxidantes y de destoxificación hepática en la rata. Nutr Hosp 2004; 19:73-82.
17. Rodeiro I, Alemán C, Más R, Acosta CP, Gámez R. D-002: Effects on Hepatic Drug Metabolizing Enzyme Activities in Rats. Biotecnología Aplicada 2001; 18:88-90.

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